Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
4%-ный раствор дифенилкарбазида (ДФК) в этаноле. Готовят ежедневно. Непосредственно перед применением 0,1 мл 1 моль/л ТЭА добавляют к 10 мл 0,4%-ного раствора ДФК;
стандартные растворы пальмитиновой кислоты (а. м. = 256,42) — 0,005 и 0,001 мкмоль/л. Для этого 25,642 мг пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл ЭС, получают 1 ммоль/л раствор. Затем 1 мл данного раствора доводят до 10 мл ЭС в мерной колбочке, получают 0,1 мкмоль/л. Далее из данного раствора путем разведения ЭС получают растворы с концентрацией 0,005 и 0,010 мкмоль/л пальмитиновой кислоты.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки с притертыми пробками на 15—20 мл; центрифужные пробирки с притертой пробкой на 10 мл; встряхиватель. Стеклянную посуду, предназначенную для определения НЭЖК, выдерживают несколько часов в 1 моль/л растворе HCI и тщательно моют деминерализованной водой.
Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят 250 мг активированной кремниевой кислоты с последующим внесением 9 мл ЭС и по 0,075 мл сыворотки (плазмы). Пробирки немедленно закрывают, закрепляют со штативом в горизонтальном положении на встряхивателе и встряхивают 10 мин, затем дают 15 мин постоять и вновь встряхивают 1—2 мин (можно вручную).
Одновременно готовят стандарт. Для этого в 3 пробирки вносят по 0,5 г кремниевой кислоты, далее в первую пробирку добавляют 9 мл ЭС, во вторую 9 мл 0,005 мкмоль/л и в третью 9 мл 0,010 мкмоль/л раствора пальмитиновой кислоты. Пробирки стандарта встряхивают вместе с пробами. Затем пробирки центрифугируют 10 мин при 2500—3000 мин и 5 мл верхней фазы переносят в пробирки с притертой пробкой, куда добавляют 2 мл раствора Cu-ТЭА. Опять встряхивают и центрифугируют. После этого 3 мл верхней фазы (осторожно, не касаясь стенок и нижнего слоя) пе-
144
реносят в обычную пробирку (опыт и контроль) и добавляют по 0,5 мл раствора ДФК, перемешивают и оставляют стоять в темном месте. Через 15 мин развивается розово-малиновая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 550 нм против воды. Расчет ведут по формуле
X = (Л/В) • 120,
где X — содержание НЭЖК, мкмоль/л; А — показатель пробы, мкмоль/л; В — показатель стандарта, мкмоль/л; 120 — постоянный коэффициент.
Перед расчетом из показаний экстракции стандартной пробы (0,010 мкмоль) следует вычесть показания экстинкции слепой пробы.
Расчет можно проводить и по калибровочному графику, который строят с использованием раствора пальмитиновой кислоты в пределах 0,005—0,025 мкмоль/л.
Клиническое значение. Концентрация НЭЖК в сыворотке крови (см. приложение 5) тесно связана с энергетической обеспеченностью организма животных и характеризует активность процессов мобилизации их из жировых депо. Поэтому при недостаточном поступлении энергии в организм, особенно в период раздоя, у самок птиц перед началом яйцекладки и в других случаях концентрация НЭЖК в сыворотке крови соответственно возрастает в 5—10 раз и более. Часто это предшествует параллельному увеличению концентрации кетоновых тел в крови.
Кратковременное повышение концентрации НЭЖК в сыворотке крови может быть результатом кормления по рационам, обогащенным кормовыми жирами; под влиянием инъекций адреналина; под воздействием стрессовых ситуаций; при сахарном диабете, ожирении, кетозе. Снижается концентрация НЭЖК при введении глюкозы и инсулина.
Источник: 4.
Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови.
Принцип. В основу метода положена модифицированная Иль-ком реакция Любермана—Бурхарда, которая дает изумрудно-зеленое окрашивание в присутствии холестерина и смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты. Данный метод позволяет определять содержание холестерина без предварительной экстракции липидов из сыворотки крови.
Реактивы: 1) смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5: 1). При смешивании ингредиентов следует избегать нагревания смеси. Для этого колбу, в которой готовят реактив, помещают в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляют в последнюю очередь медленно по каплям, постоянно помешивая. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтого цвета и сохраняться в холодильнике;
10 — 4196
145
2) стандартный раствор холестерина: 100 мг холестерина в 100 мл хлороформа.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; термостат; пробирки; штатив для пробирок; пипетки мерные на 0,1 и 5 мл.
Ход определения. К2мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, встряхивают короткими энергичными движениями и помещают в термостат на 20 мин при 37 °С. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют на спектрофотометре (длина волны 650—660 нм) или на ФЭКе (красный светофильтр) в кюветах диаметром 0,5 см против контрольной пробы на реактивы (вместо сыворотки вносят 0,1 мл воды).
Расчет ведут по предварительно составленному калибровочному графику. Рабочий раствор холестерина готовят разведением стандартного в 10 раз (10 мл стандартного раствора + 90 мл хлороформа). 1 мл рабочего раствора содержит 0,1 мг холестерина. Затем в пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3 мл рабочего раствора, что соответствует 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,25 и 0,30 мг холестерина. В седьмую пробирку вносят 1 мл хлороформа. Пробирки помещают в водяную баню для выпаривания досуха хлороформа; добавляют в них по 2 мл реактива 1 и далее поступают, как описано выше.
