Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Метод TCX позволяет разделить сложные смеси липидов на классы: фосфолипиды, моно-, ди- и триацилглицерины, НЭЖК, холестерин свободный и этерифицированный; в свою очередь, фосфолипиды на подклассы, фосфатидилхолин (лецитин), фосфа-тидилэтаноламин и т. д. и тем самым упрощает и повышает точность количественного определения отдельных классов и подклассов липидов, а также их выделение для дальнейшего изучения.
Разделение общих липидов на классы методом TCX включает следующие операции: приготовление тонкого слоя силикагеля на стекле; активизация его, нанесение общих липидов на тонкий слой; разделение липидов в системе растворителей; проявление и идентификация отдельных классов липидов; их количественное определение.
Реактивы: силикагель для TCX с величиной частицы 10—40 мкм, приготовленный путем измельчения отечественного гранулированного силикагеля марки КСК, или силикагель марки JIC 5/40 (Чехия), или аналогичных марок других фирм;
петролейный эфир с точкой кипения 40—60 °С;
диэтиловый эфир (лучше для наркоза) с точкой кипения 35—36 °С;
уксусная кислота ледяная;
хлороформ перегнанный;
йод кристаллический;
5—10%-ный раствор фосфоромолибденовой кислоты или 10—15%-ный водный раствор серной кислоты;
свидетели—соединения отдельных классов липидов: фосфолипидов, триацилглицеридов, НЭЖК, холестерина свободного и эте-
150
рифицированного. В качестве таковых используют лецитин яичного желтка, трипальмитат или триолеат, пальмитиновую или другую жирную кислоту, холестерин и холестерин-эфир любой кислоты (3—5%-ной концентрации в хлороформе, ч. д. а.).
Оборудование (по Шталю): станок для фиксации пластинок, представляющий собой гладко выструганную доску длиной 100—120 см, шириной 20,7 см с гладкими бортиками по краям и высотой 1,5—2 см. В начале и конце станка также устанавливают бортики-ограничители. Перед работой плоскость станка покрывают на всю длину полиэтиленовой пленкой;
металлический аппликатор, позволяющий наносить слой силикагеля нужной толщины, который изготавливают из цельнометаллического прямоугольного бруска нержавеющей стали (он представляет собой как бы ящик без дна 19 х 5 см по внешним параметрам). Сверху с обеих торцевых сторон бруска оставляют специальные выступы для удобства его захвата при работе. Аппликатор плотно прилегает к поверхности стекла, но его задняя стенка имеет зазор (щель) высотой 3—5 мм, толщина которой регулируется закрепляющейся на винтах подвижной пластинкой (шторкой);
пластинки стеклянные 20 х 20 или любого другого размера; кассета для сушки и хранения готовых пластинок; стеклянная камера (прямоугольник или круглая) с притертой крышкой для хроматографии; сушильный шкаф; эксикатор; микропипетки на 0,1 мл и более; пульверизатор.
Ход определения. Приготовление тонкого слоя и нанесение липидов. Хорошо вымытые, обезжиренные стеклянные пластинки закладывают в станок. На старт и финиш станка кладу пластинки шириной не более 5—6 см. Все стекла еще раз протирают хлороформом. На старт помещают аппликатор с предварительно отрегулированной шириной зазора (250—300 мкм для разделения липидов на классы и 350—500 мкм для разделения фосфолипидов на подклассы), обращенного к переднему концу станка.
В коническую колбу вместимостью 150—200 мл отвешивают силикагель (из расчета 5 г на одну пластинку 20 х 20 см) и заливают двойным объемом дистиллированной воды, закрывают пробкой и энергично встряхивают 90 с до получения однородной массы (без пузырьков), затем быстро выливают в аппликатор и непрерывным плавным движением прибора наносят слой силикагеля на стеклянные пластинки. Слой должен быть гладким, без пустот и наплывов.
Пластинки оставляют на ночь при комнатной температуре, а перед использованием их помещают в сушильный шкаф на 1—2 ч при 110 0C для активизации. После охлаждения пластинки с нижнего края ее на 0,3—0,5 см удаляют силикагель, а на 1—1,5 см выше иглой намечают линию старта.
Пробы липидов наносят (осторожно!) микропипеткой или микрошприцем с иглой в виде отдельного пятна или полосы шириной 1—1,5 см. Расстояние от краев стекла составляет 2 см, а между про-
151
бами 2—3 см. Рядом с пробой наносят раствор каждого свидетеля в отдельности или их смесь.
Приготовление хроматографической камеры и подвижной фазы. Дно и внутренние стенки покрывают чистой фильтровальной бумагой и смачивают подвижной фазой, в которой будет проводиться разделение липидов. Это создает хорошее насыщение камеры парами подвижной фазы, что улучшает разделение. Подвижную фазу наливают в камеру в таком объеме, чтобы хорошо пропиталась фильтровальная бумага и на дне был слой толщиной 1—1,2 см. Камеру закрывают прошлифованной крышкой и ставят под вытяжной шкаф (все делается под вытяжным шкафом!).
В качестве подвижной фазы используют ряд смесей (табл. 24).
24. Состав подвижных фаз п соотношение в пих отдельных компонентов, объем/объем
Компонент
Подвижные фазы
1
2
3
4
5
6
Петролейный эфир (/кип 40-60 °С)
85
80
82
