Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Примечания. Метилирующие смеси в лабораторных условиях готовят следующим образом:
1) для приготовления 0,5 моль/л раствора натрия ме-тилата (CH3CONa) осторожно растворяют 2,299 г металлического натрия в 100 мл абсолютного метанола;
2) для приготовления 3%-ного раствора серной кислоты 1,63 мл H2SO4 (ч. д. а.) растворяют в 100 мл абсолютного метанола;
3) для приготовления 0,3 н. хлористого водорода поступают следующим образом. В колбу Бунзена на 0,5 или 1 л вносят 200—250 г натрия хлорида (NaCl), закрывают ее корковой или резиновой пробкой с отверстием, в которое вставляют делительную воронку на 200 мл, наполненную концентрированной серной кислотой (100—150 мл). По мере вливания (по каплям) кислоты в колбу с натрия хлоридом происходит реакция с выделением газообразного хлористого водорода, который через резиновый шланг, надетый на боковой отросток колбы и заканчивающийся стеклянной пипеткой, отводят во флакон с метанолом (через резиновую пробку), насыщая его до указанной выше концентрации. По завершении реакции в колбочку отбирают 10—15 мл метанола, вносят 1—2 капли индикатора Ташира и титруют 0,1 н. раствором NaOH для определения концентрации HCl;
4) если метиловые эфиры или липиды требуют хранения, то их следует продуть азотом, ампулы запаять, а пробирки закрыть пробками и залить парафином. Поместить в герметически закрывающуюся емкость и хранить в холодильнике;
5) если ставится цель изучить жирнокислотный состав отдельных классов липидов (фосфолипидов, триацилглицеринов, НЭЖК, эфиров холестерина) или подклассов фосфолипидов, то предваритель-
11 —4196
161
но их разделяют методом TCX на стеклянной пластинке (для количественного анализа). Экстрагируют определенным растворителем и метилируют любым указанным выше способом.
Разделение, идентификация жирных кислот и расчет площади их пиков. Пробу метиловых эфиров жирных кислот вводят в колонку специальным микрошприцем через самоуплотняющуюся резиновую мембрану инжектора путем быстрого нажатия на поршень. Если предусматривается получить только процентное соотношение жирных кислот в пробе, то точность объема вводимой пробы не имеет значения (однако он должен быть оптимальным). При калибровке прибора объем пробы должен быть точно измерен.
Как указывалось выше, смесь метиловых эфиров, проходя по колонке с газом-носителем, селективно удерживается жидкой фазой и распределяется в колонке по мере увеличения длины их углеродной цепи. Выходя из колонки, метиловые эфиры отдельных жирных кислот попадают в детектор и изменяют в нем электропроводность.
В настоящее время в лабораторной практике наибольшее применение получили газожидкостные хроматографы с пламенно-ионизационными детекторами и детекторами по теплопроводности (катарометрами).
Принцип работы ионизационных детекторов основан на том, что электропроводность газа прямо пропорциональна концентрации в нем заряженных частиц. Жирная кислота, выходящая из колонки в виде газа, смешивается с водородом и сжигается в атмосфере воздуха или кислорода. Ионы и электроны, образованные в пламени, попадают в межэлектродное пространство, уменьшают его сопротивление, в результате чего во внешней цепи возникает ток (электросигнал). Последний через усилитель регистрируется самописцем в виде соответствующих пиков.
Пламенно-ионизационный детектор чувствителен фактически ко всем соединениям, за исключением Не, Ar, Kr, Ne, Xe, O2, Cs2, COS, SiHCl3, SiF4, H2S, SO2, NO, N2O, NO2, NH3, СО, CO2, H2O, SiCl4.
Принцип работы детектора по теплопроводности основан на том, что нагретое тело теряет тепло со скоростью, зависящей от состава окружающего газа, поэтому скорость теплоотдачи используется здесь для определения состава газа. Основным элементом катарометра служит металлическая нить, скрученная в спираль и расположенная внутри камеры в металлическом блоке. Нить нагревают, пропуская через нее постоянный ток. Температура нити определяется равновесием, устанавливающимся между входной электрической мощностью (I R) и мощностью тепловых потерь, связанных с отводом тепла окружающим газом. При пропускании через детектор чистого газа-носителя потеря тепла постоянная, поэтому температура нити также постоянная. При наличии в газе-носителе анализируемого вещества температура нити изменяется, что вызывает соответствующее изменение электрического сопротивления, передающегося на самописец.
162
Пламенно-ионизационный детектор во много раз чувствительнее катарометра.
В тех случаях, когда проба анализируемого вещества растворена в хлороформе или гексане, через несколько секунд после ее введения в колонку сигнал детектора от растворителя регистрируется резким сдвигом пера самописца, а после ее выведения возвращается обратно до или почти до базисной линии. Если в качестве растворителя используется сероуглерод, то сигнал не регистрируется.
Через несколько секунд или минут самописец начинает записывать сигналы, обусловленные выходом метиловых эфиров жирных кислот, начиная с самых коротких (6 : 0, 8 : 0, 10 : 0) и кончая самыми длинными (20 : 4, 22 : 0 и т. д.).
