Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
процессом и подчиняется закону пуассоновского распределения, при котором стандартное отклонение пропорционально квадратному корню из общего числа накопленных импульсов. Практически это означает, что при повторных определениях радиоактивности в одном и том же образце 95% всех величин должны лежать в пределах, даваемых средней величиной плюс и минус удвоенный квадратный корень средней величины. Таким образом, для каждого данного числа импульсов можно непосредственно рассчитать ошибку, не прибегая к помощи эксперимента.
Применение этого вывода при выборе необходимого уровня счета показано в табл. 10.1. Из приведенных цифр следует, что увеличение точности в интервале между 10 000 и
Таблица ЮЛ
Теоретическая ошибка определения радиоактивности при различном числе импульсов (Ошибка равна квадратному корню из общей величины счета и выражена в процентах от общего числа импульсов)
Общее число Ошибка (%) Общее число Ошибка (%)
импульсов импульсов
100 000 0,3 5 000 1,4
50000 0,4 2 000 2,2
20000 0,7 1 000 3,2
10 000 1.0 500 7,0
100000 импульсов очень мало, причем оно сравнительно невелико также (по сравнению с другими погрешностями метода анализа) в интервале между 2000 и 10 000 импульсов. Следует также подчеркнуть, что ошибка счета не зависит от других ошибок и поэтому не является простым дополнением к ним. Так, если технические ошибки обусловливают разброс результатов анализа на 2%, то при 10000 накопленных импульсов-общая ошибка составит только 2,2%, а при 2000 импульсов она будет равна 3%. В связи с этим в большинстве методов анализа точность будет вполне удовлетворительной, если число импульсов в пределах калибровочной кривой составляет 2000—10000. Лишь в редких случаях, когда система технически безупречна, увеличение числа импульсов может дать какой-то выигрыш. В нормальных условиях увеличение продолжительности счета, а следовательно, числа импульсов ни в коей мере не может заменить правильного проведения других стадий анализа.
7 т. Ч«рд
10.2.2. Ошибки, связанные с техникой проведения анализа
Для системы с хорошо продуманной методикой и адекватными реагентами одной из наиболее важных причин разброса результатов параллельных анализов являются технические ошибки.
Технические ошибки возникают в тех случаях, когда в пробирку забывают, например, добавить реагент или образец, путают образцы друг с другом или допускают серьезные ошибки при расчете результатов. Чаще всего, хотя и не всегда, оператор сам обнаруживает такого рода ошибки. В этих случаях повторяют анализ испорченных образцов и при расчете коэффициента, характеризующего разброс отдельных анализов, отбрасывают соответствующие результаты. -
Более важными (поскольку их труднее обнаружить или исправить) являются мелкие ошибки, обусловленные неизбежным разбросом параллельных анализов из-за нетожде-ственности повторяющихся операций пипетироваиия, без которых не может быть реализован метод связывания. Такие ошибки возникают как за счет неточности используемого оборудования, так и по вине самого оператора, работающего с этим оборудованием.
1) Ошибки, обусловленные неточностью оборудования. Используемые в настоящее время дозаторы по своей точности намного превосходят то оборудование, которое применялось для пипетироваиия при разработке радиоиммунологиче-ских методов анализа и состояло в основном из стеклянных пипеток. Существует два основных типа дозаторов: ручные автоматические пипетки с поршнем и пружинным возвратом и механические дозаторы (см. Приложение 1). Воспроизводимость при работе с лучшими моделями автоматических пипеток (если их содержать в хорошем состоянии и правильно ими пользоваться) может быть лучше 0,5%; в действительности же при работе с ними часто бывает трудно определить ошибку пипетироваиия, поскольку она не превышает ошибки контрольных методов, например взвешивания при помощи аналитических весов. Нельзя, однако, слепо доверять высокому качеству автоматических пипеток; необходимо время от времени проверять точность их работы. Очень важно также, чтобы пипетки содержались в чистоте и порядке, поскольку следы грязи вокруг поршней и клапанов могут сократить срок действия пипеток и привести к серьезным ошибкам дозирования.
2) Ошибки оператора. Многие ошибки при радиоиммуно-логическом анализе можно с полной уверенностью отнести за счет недочетов и погрешностей в работе оператора. Это по-
ложение со всей очевидностью подтверждается двумя хорошо известными фактами. Во-первых, при проведении анали» зов разными операторами в один и тот же день с использованием одних и тех же реагентов часто наблюдаются значительные различия в точности. Разница, по крайней мере частично, зависит от квалификации — начинающий редко может сравниться с опытным оператором. Во-вторых, с увеличением числа анализируемых проб точность, как правило, падает (фактор усталости). По приблизительным подсчетам _ максимальное число анализов, которое может выполнить за день вручную один оператор, не должно превышать 500. Обычно трудно определить конкретные причины допускаемых ошибок, они могут быть связаны с недостаточно полным перемешиванием, с тем, что капли реагента остаются на стенках пробирки или в наконечнике пипетки, или же с неодинаковым сливанием или отбиранием надосадочной жидкости.
