Радиоиммунологические методы - Чард Т.
Скачать (прямая ссылка):
10.2.1.2. Ошибки, связвииые ее епосебем разделения
Способ разделения связанного и свободного лиганда может оказывать существенное влияние на точность анализа. Некоторые способы разделения (особенно ранее применявшиеся методики, в которых связывающий агент адсорбировали на стенках пробирок; разд. 5.3.6.1) сами по себе характеризуются плохой воспроизводимостью и требуют для получения надежных результатов большого числа параллельных определений. Значительно хуже известно (поскольку его редко обсуждают) то влияние, которое оказывает на точность анализа величина холостой пробы — эффект, имеющий место при любом способе разделения). Холостая проба (как и все другие параметры) может варьировать: иногда вариации связаны с техническими погрешностями, но значительно чаще — с различиями между отдельными анализируемыми образцами. Допустим, что связанные с этим фактором различия составляют 10% от числа импульсов в пробирках с холостой пробой. Эта величина почти не отразится на точности анализа, если холостая проба составляет 1% (следовательно, разброс составляет 0,1%), а связывание в нулевом стандарте равно 50%. Если, однако, связывание в нулевом стандарте составляет 30%, а холостая проба равна 15% (следовательно, разброс составляет 1,5%), то указанные вариации могут уже оказать весьма существенное влияние на точность анализа. Из сказанного следует, что при низком связывании в нулевом стандарте (менее 40% общего числа импульсов) нельзя применять такие способы разделения (иапример, осаждение связанной фракции этанолом или сульфатом аммония), которые дают высокую холостую пробу.
Большое влияние на точность анализа может оказывать также методика разделения. Она должна быть построена таким образом, чтобы точное количество агента, используемого для разделения, не оказывало существенного влияния на результат анализа. Так, если требуемый объем добавляемого органического растворителя составляет 1 мл, то добавление вместо этого 0,8 или 1,2 мл не должно заметно влиять на результаты. Если колебания в объеме растворителя могут варьировать в широких пределах, то этим устраняется один из потенциальных источников ошибок (рис. 10.2).
10.2.1.3. Ошибки, связанные с неравновеоностью
Как правило, в большинстве методов связывания инкубацию продолжают до тех пор, пока не установится равновесие. Однако в некоторых случаях разделение связанного и свободного лиганда приходатся проводить до установления
/{олхуестм агея/ял, /грилгеяяемого ftrsr разделения
Рис. 10.2. Теоретический пример,* показывающий влияние способа разделения на точность анализа. В системе Б даже небольшие колебания количества агента, применяемого для разделения, должны были бы существенно влиять на наблюдаемое соотношение свободного и связанного лигандов. Для системы А характерен широкий интервал (плато), внутри которого количество добавляемого агента, применяемого для раз» деления, не играет существенной роли, и даже значительные его колебания ие должны влиять на результаты анализа. Более предпочтительными являются системы типа А
равновесия (разд. 8.2.4). Такой прием является потенциальным источником ошибок, поскольку если время разделения составляет значительную часть от общего времени анализа, то между первой и последней анализируемыми пробирками может возникнуть заметная разница.
10.2.1.4. Ошибки, связанные со стандартами
Пожалуй, самым главным источником ошибок, связанных с основными реагентами, служат погрешности, допускаемые при приготовлении стандартных растворов. Основные правила приготовления стандартных растворов уже рассматривались (разд. 2.5 и табл. 2.1), однако на некоторых из них следует остановиться еще раз.
1) Отдельные серии стандартных растворов всегда следует готовить в виде аликвот исходного раствора, приготовленного в большом объеме, отдельно для каждой концентрации. Подобный прием удобен и позволяет избежать ошибок, которые могут возникнуть, если стандартные растворы готовят заново для каждого анализа.
2) Стандартные растворы разных концентраций следует готовить независимо путем разбавления одного и того же исходного раствора. Против последовательных разбавлений
СтанЯар/п А!РГ/.\ нг/мл
Рис. ЮЛ. Калибровочные кривые для двух серий стандартных растворов чистого препарата а-фетопротеина, одна из которых содержит, а другая не содержит белок-носнтель (2 иг/ил бычьего сывороточного альбумина). Б отсутствие белка-носнтеля наблюдается постепенная потеря лиганда за счет его неполного переноса, обусловленная адсорбцией иа стенках пробирок; в результате нараллельность кривых резко нарушается; /—в отсутствие белка-носителя, II—в присутствии белка-носителя. (Данные любезно предоставлены д-pou М. Эл-Оквейти.)
можно выдвинуть ряд возражений, главные из которых состоят в том, что ошибка, допущенная на каком-нибудь одном этапе приготовления, будет сказываться на всех последующих этапах, а адсорбция на стенках пробирок по мере уменьшения концентрации стандарта может приводить ко все более сильному занижению истинного количества вещества, добавляемого в пробы (пример подобной ситуации приведен на рис. 10.3).
