Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Чард Т. -> "Радиоиммунологические методы" -> 73

Радиоиммунологические методы - Чард Т.

Чард Т. Радиоиммунологические методы — М.: Мир, 1981. — 248 c.
Скачать (прямая ссылка): radioimunnologicheskiemetodi1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 100 >> Следующая

В принципе существуют два. возможных способа истощения антисыворотки. Один из них заключается просто в добавлении перекрестно-реагирующего вещества и в удалении образовавшегося иммунопреципитата при помощи центрифугирования; недостаток этого способа состоит в том, что комп-
л»/мл
Рае. 9.4. Повышение специфичности путей истощения аитисыворотки. Антисыворотка получена при иммунизации чистым препаратом фрагмента D (FgD)—одного нз конечных продуктов расщепления фибриногена—и затем истощена фибриногеном. При использовании фрагмента D, меченного изотопом 1Я1, антисыворотка не дает перекрестной реакции с нитактиым фибриногеном (при взятых концентрациях) н относительно слабо взаимодействует с фрагментом Е (Fg Е). Поскольку фрагмент D явлнетсн частью молекулы фибриногена, данный метод анализа является специфичным длн неоантнгена, т. е. для антигена, образующегося в процессе протеолнтического расщепления фибриногена (Данные любезно предоставлены д-ром И. В. Гордоном.)
лексы могут оставаться в растворенном виде в связи с избытком антигена. Второй способ заключается в добавлении перекрестно-реагирующего вещества в нерастворимой форме, как это имеет- место, например, при анализе белков, когда для образования перекрестных связей добавляют глутаровый альдегид. Боле% универсальный и широко распространенный способ включает использование антигена, связанного с твёрдой фазой типа целлюлозы или сефадекса. Твердую фазу в этих случаях можно либо добавлять непосредственно к анти-сыворотке, либо заполнять ею колонки, на которые наносят антисыворотку и затем проводят элюцию.
Методы разделения свободного и связанного лиганда. На специфичность метода анализа может влиять способ разделения. Показано, например, что перекрестное влияние 5а-ди-гидротестостерона можно значительно уменьшить, если вместо угля, покрытого декстраном, использовать для разделения сульфат аммония (Tyler et al., 1973). Механизм этого явления пока неясен.
9.3. Неспецифическая неспецифичность
Этот термин относится к тем случаям, когда неспецифичность анализа обусловлена иными факторами, чем те, которые можно четко идентифицировать на основании их физи-
ко-химического сходства с лигандом. Чаще всего такая не-специфичность проявляется в том, что при анализе неизвестного образца путем измерения кажущейся концентрации ли* ганда эта концентрация оказывается выше концентрации, измеренной с помощью других независимых методов анализа. В некоторых случаях, однако, неспецифические эффекты могут приводить к заниженным значениям кажущейся концентрации по сравнению с величинами, получаемыми при помощи других методов анализа.
Существуют четыре основных механизма, лежащих в основе неспецифической неспецифичности: 1) присутствие в образце вещества, препятствующего взаимодействию связывающего агента с лигандом; 2) разброс величин холостой пробы в анализируемых образцах; 3) разрушение или инактивация связывающего агента или меченого лиганда и 4) разрушение или инактивация немеченого лиганда.
9.3.1. Присутствие веществ, препятствующих взаимодействию между связывающим агентом и лигандем
Известен ряд веществ, препятствующих взаимодействию между связывающим агентом и лигандом. Такого рода явление наблюдается, в частности, в присутствии больших количеств сильно заряженных веществ (таких, как гепарин), высоких концентраций низкомолекулярных соединений (таких, как соли и мочевина), а также кислот и щелочей. Пример, иллюстрирующий влияние кислоты, показан на рис. 6.2.
9.3.2. Разброс величины холостой прсбы в образцах
Природа анализируемой жидкости может оказать существенное влияние на величину холостой пробы. Так, при исполь-зовании в качестве метода разделения осаждения органическими растворителями величина холостой пробы в пробирках, содержащих цельную сыворотку, должна быть значительно выше, чем в пробирках, содержащих буферный раствор с добавлением белка-носителя (т. е. в стандартах); в этих условиях концентрации лиганда, найденные в анализируемых образцах, будут ниже истинных величин (рис. 9.5). Более того, в различных образцах одной и той же жидкости величины холостой пробы могут быть разными. Этого можно избежать, если определять величину холостой пробы для каждого образца (т. е. анализировать параллельные пробы, содержащие образец и меченый лиганд, но не содержащие антител), од-
1 г 4 в 1в зг
/Сащенглрацс/я cmaHdap/mr
Рнс. 9.5. Теоретические кривые, показывающие влияние разброса величины холостой пробы на специфичность метода связывания. Если величина холостой пробы для образца выше, чем для стандарта, то результат будет занижен. При идентичном составе анализируемых образцов и стандартов эта проблема практически не возникает.
нако проведение таких определений очень трудоемко и прак-тически редко бывает необходимым.
9.3.3. Разрушоиио или инактивация связыоающого агоита или моченоге яигаида
В большинстве систем связывающий агент обладает относительной стабильностью и не подвергается необратимым повреждениям. Однако с меченым лигандом дело обстоит иначе. Существуют по меньшей мере три типа процессов, влияющих на поведение меченого лиганда — ферментативное расщепление, адсорбция на поверхности и связывание с эндогенными антителами. Ферментативное расщепление имеет важное значение в тех методах анализа, в которых используются иодированные пептидные гормоны, и в частности небольшие пептиды типа вазопрессина или ангиотензина. Указанные пептиды легко могут гидролизоваться ферментами, присутствующими в нормальной плазме или сыворотке, что вызывает уменьшение связывания, причем это уменьшение трудно отличить от того, которое вызывается присутствием немеченого лиганда (рис. 9.6). Адсорбция на поверхности, например на стенках стеклянных пробирок, также часто наблюдается в случае небольших пептидов; она может иметь
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 100 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed