Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
под вакуумом, промывают холодным этанолом и диэтиловым эфиром, высушивают
в вакуум-эксикаторе и растирают в ступке. Хранят РНК-Na в плотно закрытой
склянке при 4° С.
Для определения активности РНКаз реакционную смесь, содержащую 0,5 мл
водного раствора PHK-Na (8 мг/мл), 0,4 мл 0,2 М буфера (соответствующего
pH, например, 7,9) или 0,2 М ацетатного буфера (pH 5,0) и 0,4 мл раствора
фермента, инкубируют в течение 25 мин при 25 С. Реакцию останавливают
добавлением 0,5 мл 0,75%-ного раствора уранилацетата в 25%-ной хлорной
кислоте и доводят объем до 3,0 мл водой. После 30-минутного отстаивания
при 4° С осадок удаляют фильтрованием. 0,1 мл фильтрата вносят в 3 мл
дистиллированной воды и измеряют светопоглощение при 260 нм. В
контрольную пробу раствор фермента вносят после добавления уранилацетата.
За единицу активности РНКазы принимают ее количество, которое вызывает
увеличение светопоглощения при 260 нм (ДА2б0) на 1,0 при описанных
условиях определения. Если величина ДА2б0 превышает 0,200-0,250, то
определение активности повторяют с большим разведением фермента.
Активность РНКазы (ед./мл) рассчитывают с учетом количества фермента,
взятого на определение (0,4 мл), и его исходного разведения, не принимая
во внимание все последующие разведения фермента в процессе определения
активности.
У.8.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НУКЛЕАЗ, ВКЛЮЧАЯ ДНКазы
Активность ДНКаз и нуклеаз может быть определена приведенным выше
методом, но с использованием ДНК в качестве субстрата, а также с
введением в реакционную смесь катионов двухвалентных металлов, чаще всего
Mg2+, при соответствующих значениях pH, так как большинство нуклеаз имеют
оптимальную активность как в кислой, так и в слабощелочной среде (табл.
13) и являются металлозависимыми белками.
ДНК обычно растворяют в слабом растворе соли (например, 0,03 М NaCl). Для
получения раствора денатурированной ДНК его нагревают при 100° С 10-15
мин и быстро охлаждают на ледяной бане. Реакционную смесь обычно
инкубируют при 37° С 15, 30 или 60 мин. Нерасщепленный субстрат осаждают
раствором уранилацетата в хлорной кислоте (НСЮ4) в указанных выше
концентрациях или 0,25%-ным уранилацетатом в 2,5%-ной хлорной кислоте,
или только хлорной кислотой. После выдержки на холоду (от 15 мин до 1 ч)
осадок удаляют центрифугированием или фильтрованием и после
соответствующего разведения фильтрата или центрифугата дистиллированной
водой измеряют его светопоглощение при 260 нм.
205
Таблица 13. Некоторые свойства нуклеаз грибов [23]
Фермент Продуцент Оптимум pH Активаторы
Нуклеаза Sj Aspergillus ory- 4,0-4,6 Zn2+, Co2+
Нуклеаза О zae A. oryzae 7,7-8,2 Mg2+(0,1 mkM), Mn2+
ДНКаза Кх A. oryzae 8,5-9,5 Mg2+
ДНКаза К2 A. oryzae 8,0 M;2+ (1 мкМ РНК и 0,1
мкМ ДНК)
ДНКаза * A. oryzae 8,2 Co2+, Mg2+ и Mn2+
51-Нуклеаза A. quercinus 00 СП 1 00 00 Zn2+, Ca2+
Нуклеаза Penicillium citri-num 4,5-6,2
РНКаза E-III Phoma cucurbita- 5,5 Mg2+, Ca2+
cearum Mg2+, Mn2+
ДНКаза Rhizopus sp. 7,8-8,0
* [758].
В качестве примера ниже приведены два способа определения активности
нуклеазы Acrocylindrium sp. [786].
1. Состав реакционной смеси (0,4 мл): 2 мг высокомолекулярной дрожжевой
РНК; 2 мкмоля МпС12, 50 мкмолей Трис-HCl буфера (pH 7,5) и 0,55 - 1,1 мкг
эндонуклеазы. Инкубация в течение 15 мин при 37 С. Реакцию прекращают
добавлением 0,4 мл охлажденной 10%-ной хлорной кислоты. После 20 мин
выдерживания при 0° С осадок удаляют центрифугированием в течение б мин
при 4000 g. 0,1 мл центрифугата разводят до 4,0 мл дистиллированной водой
и измеряют абсорбцию при.260 нм в спектрофотометре по отношению к
контролю без фермента.
2. Состав реакционной смеси (0,4 мл): 600 мкг ДНК; 2 мкмоля МпС12; 20
мкмолей Трис-HCl буфера (pH 8,0) и 0,022 мкг эндонуклеазы. Инкубация в
течение 15 мин при 37° С. Реакцию прекращают добавлением 0,4 мл холодной
10%-ной хлорной кислоты. После 20 мин выдерживания при 0° С осадок
удаляют центрифугированием при 7700 g; 0,2 мл центрифугата разводят
дистиллированной водой до 4,0 мл и измеряют абсорбцию при 260 нм против
контроля. Активность выража-ют в АА2в0.
Если в исследуемом растворе присутствуют РНКазы и нуклеазы и в качестве
субстрата используют РНК, для подавления активности нуклеаз в реакционную
смесь вводят ЭДТА, являющийся ингибитором металлозависимых ферментов.
V.8.4.1. НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕАЗ
Помимо различных модификаций спектрофотометрических методов определения
активности нуклеаз имеются и нефелометрические методы, преимущество
которых заключается в использовании более простого оборудования.
Данный метод характеризуется тем, что после инкубации реакционной смеси
при 37° С реакцию прекращают добавлением равного объе-
206
ма 1 н. НС1, мутность измеряют в нефелометре (ФЭК-Н) с зеленым
светофильтром и сравнивают с контролем. Активность фермента выражают в
единицах оптической плотности. Ниже приведен один из примеров.
Состав реакционной смеси: 0,25 мл раствора ДНК тимуса (2мг/мл); 1,0 мл
