Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
засевают испытуемыми культурами грибов. О наличии гемолитических свойств
у микроорганизмов судят по величине зоны гемолиза - зоны просветления
кровяного агара (в миллиметрах).
2. Культуральную жидкость после культивирования грибов при определенных
условиях вливают (по 0,1-0,2 мл) в специальные металлические или
стеклянные цилиндрики, установленные в застывшем кровяном агаре в чашках
Петри. Чашки выдерживают в термостате
208
1-4 сут при различной температуре. Появление вокруг цилиндриков зон
просветления указывает на способность фильтрата вызывать гемолиз.
V.9.I.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
1. В пробирки наливают 1 объем цитратной крови (к 20 мл крови прибавляют
16 мг лимоннокислого натрия для предотвращения свертывания) и 1 объем
тромбина; при этом возникают плотные цилиндрической формы тромбы
диаметром 8 мм и длиной 15 мм (размеры тромба зависят от количества крови
и тромбина в пробирке). К тромбам приливают культуральную жидкость (2-3
мл), выдерживают в термостате при 30-37° С. О фибринолитической
активности судят по скорости растворения тромба.
2. Фибринолитическую активность грибов можно определять методом пластин.
В колбе Эрленмейера емкостью 50 мл смешивают 10 мл 0,3%-ного раствора
фибриногена и 0,3 мл 1%-ного раствора тромбина (приготовленные на
физиологическом растворе). Смесь фибриногена и тромбина быстро вливают в
стерильные чашки Петри диаметром 10 см. Под влиянием тромбина фибриноген
превращается в нерастворимый гельфибрин, на поверхность которого
микропипеткой наносят по 0,03 мл культуральной жидкости. На каждой чашке
можно сделать три-четыре определения. Пленки инкубируют при 38° С; время
инкубации различно. Фибринолитическую активность оценивают по величине
зоны лизиса фибрина и выражают в условных единицах на 1 мл культуральной
жидкости (1 условная единица соответствует зоне лизиса в 10 мм).
У.9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ!
АКТИВНОСТИ [334]
Определенное количество обезжиренного молока (например, 100 мл)
гомогенизируют с 50 мл 0,02 М СаС12, выдерживают при температуре 25 или
37° С, доводят pH до 6,1. В стандартные пробирки с 10 мл молока добавляют
1-2 мл культуральной жидкости или раствора фермента, перемешивают и
ставят в ультратермостат или водяную баню при указанных температурах.
Отмечают по секундомеру время внесения фермента или культуральной
жидкости и время начала свертывания молока, которое определяют по
возникновению молочных сгустков на стенках пробирок при встряхивании.
Активность фермента выражают в секундах .
V.9.3. ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПРОТЕАЗ [32]
Метод основан на уменьшении вязкости растворов белков под действием
ферментов. Раствор какого-либо белка достаточно вязкой консистенции
(обычно 1-2%-ный раствор желатина) наливают в вискозиметр Оствальда и
помещают в водяной термостат при температуре 30° С. Через 10 мин, когда
раствор желатина приобретет данную температуру, измеряют его вязкость.
Затем к раствору добавляют исследуемый ферментный препарат и через
определенные промежутки времени (3- 5-7 мин и т. д.) измеряют вязкость
раствора. Чем активнее фермент, тем быстрее уменьшается вязкость.
Активность ферментного препарата выражают в секундах.
209
V.9.4. МЕТОД ФОРМОЛЬНОГО ТИТРОВАНИЯ [32]
В результате ферментативного гидролиза белков протеолитическими
ферментами разрушаются пептидные связи с освобождением эквивалентных
количеств аммиака и карбоксильных групп, которые учитывают разными
способами. Однако определение аммиака и карбоксильных групп в амфотерных
электролитах, т. е. аминокислотах, полипептидах, сопряжено с большими
трудностями, так как свободные аммиачные группы, обладающие щелочными
свойствами, нейтрализуются в водной среде свободными карбоксильными
группами, имеющими кислый характер. Для предотвращения этого процесса в
водные растворы аминокислот вводят раствор формалина, который связывает
аминные группы; карбоксильные группы оттитровывают щелочью и косвенным
путем определяют количество аминных групп.
Степень гидролиза определяют по разности между количеством щелочи,
затраченным на титрование до и после гидролиза. Концентрация водородных
ионов, при которой карбоксильные группы полностью нейтрализуются щелочью,
находится в пределах pH 9-9,5 при интенсивно красном окрашивании по
фенолфталеину.
Реактивы: 0,5%-ный раствор фенолфталеина в 50%-ном растворе спирта; 0,2
н. раствор NaOH; свежеприготовленный раствор формоль-ной смеси (к 50 мл
40%-ного (промышленного) формалина прибавляют 2 мл 0,5%-ного раствора
фенолфталеина и нейтрализуют 0,2 н. NaOH до слабо-розового цвета).
Последовательность определения. К определенному количеству гидролизата
белка или разжиженного под действием протеолитических ферментов желатина
(например, 5 мл) прибавляют две капли фенолфталеина и оттитровывают 0,2
н. NaOH до слабо-розовой окраски. Контролем служит такое же количество
дистиллированной воды (свободной от С02) или же раствор белка, не
