Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 99

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 279 >> Следующая

0,1 М буфера соответствующего pH; 0,5 мл 0,03 М MgCl2; 0,65 мл
дистиллированной воды и 0,1 мл исследуемого раствора. Смесь выдерживают в
термостате при 37° С в течение 30 мин. Затем прибавляют 2,5 мл 1 н. НС1,
перемешивают и измеряют оптическую плотность.
В контрольную пробу исследуемый раствор вносят после раствора соляной
кислоты. Под действием фермента оптическая плотность взвеси уменьшается.
За единицу активности часто принимают изменение оптической плотности на
0,1 в указанных условиях определения [367].
У.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗ
У.9.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ГРИБОВ ПРИ ПЕРВИЧНОМ ОТБОРЕ
С целью изыскания штаммов - продуцентов ферментов - необходимо проводить
первичный отбор микроорганизмов. Для первичного отбора продуцентов
протеиназ грибы культивируют на различных средах: 10- и 5%-ном водном и
мясо-пептонном желатине (кислая и нейтральная среды), обезжиренном
молоке, яичном альбумине, кровяном агаре и др.
V.9.I.I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖЕЛАТИНАЗНЫХ СВОЙСТВ
Желатин разливают в пробирки по 3-5 мл (строго придерживаясь выбранной
дозы) и стерилизуют сухим паром. Для определения изменения pH в процессе
роста микроорганизма в желатин добавляют индикатор - бромтимоловый синий
(0,1%-ный раствор). В кислой среде желатин окрашивается в желтый цвет, в
щелочной - в синий.
1. Посев культуры гриба из пробирок со скошенным агаром на желатиновые
среды осуществляют уколом петли. Среды ставят в термостат с определенной
температурой. Через определенные промежутки времени (1, 2 и т. д. суток)
пробирки со средой ставят в холодильник для застывания желатина. Спустя 1
ч, пробирки вынимают, слегка встряхивают. Если микроорганизм продуцирует
протеолити-ческие ферменты, то столбик желатина разжижается. По
количеству разжиженного желатина (выраженному в миллиметрах столбика
желатина) судят о наличии протеолитических ферментов и их относительной
активности. Например, через 1 сут после посева один штамм гриба разжижает
5 мм столбика желатина (весь столбик желатина в пробирке равен 30 или 50
мм), а другой за это же время - 15 мм; очевидно, что второй штамм
обладает более активным комплексом протеолитических ферментов.
2. В качестве субстрата используют обычную фотопленку или РФ-3. Пленку
засвечивают, проявляют и закрепляют. В пробирки наливают по 3-5 мл
фильтрата культуральной жидкости или вытяжки из мицелия, помещают в
каждую пробирку полоску разрезанной пленки
207
(0,5 X 2 см) и ставят в термостат при 30-35° С. Через определенные
промежутки времени (часы, сутки) учитывают степень гидролиза слоя
эмульсии и определяют время, за которое пленка становится прозрачной. В
случае высокой протеолитической активности культуральной жидкости пленка
может стать прозрачной уже через 20-30 мин.
V.9.I.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
Обезжиренное или сепарированное молоко (цельное молоко центрифугируют 1 ч
со скоростью 3000 об/мин) разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при
давлении 0,5 атм в течение 20-30 мин. Затем испытуемые грибы пересевают с
сусло-агаровых косяков в пробирки с молоком и ставят в термостат при
определенной температуре. Учет результатов проводят через 1, 2 и т.д.
сут. При этом может наблюдаться свертывание молока или его пептонизация,
либо сначала пептонизация, а затем свертывание. При свертывании
образуется сгусток, а при пеп-тонизации молоко становится прозрачным.
Иногда оба процесса происходят одновременно. Активность казеинолитических
ферментов определяют по степени свертывания или пептонизации и по
скорости этих процессов, т. е. по времени.
V.9.I.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
Состав среды (г) : 1 л дистиллированной воды; 1 К2НР04; 0,5MgSO4; 0,5
КС1; 0,01 FeS04, два взбитых яичных белка. Полученную таким образом
жидкую (мутную) белковую среду разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют
текучим паром. Посев грибов производят так же, как при определении
казеинолитических свойств грибов. Пробирки помещают в термостат с
определенной температурой и через 1,2 и т.д. суток определяют
альбуминазную активность по степени просветления столбика белковой среды
в пробирке и скорости этого процесса. Вместо жидкой среды употребляют
агаризованную, и по наличию и размерам зон просветления вокруг растущей
колонии гриба определяют присутствие ферментов.
V.9.I.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
Существует несколько методов выявления у грибов ферментов, вызывающих
гемолиз крови и растворение тромбов. Ниже приведены некоторые из них.
1. Стерильно взятую кровь (из вены кролика) разливают в бутылочки
(колбочки), на дне которых находятся стеклянные бусинки. Кровь с
бусинками тщательно взбалтывают 20-30 мин для дефиб-ринизации. К 100 мл
стерильного суслового агара, нагретого до 45° С, приливают 5 мл
дефибринизированной крови, перемешивают и разливают по 10 мл в чашки
Петри. Перед началом опыта чашки Петри с кровяным агаром ставят на сутки
в термостат при 37° С, чтобы определить ее стерильность. Чашку Петри
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed