Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
формы аконитовой кислоты в лимонную и изолимонную. Следующая реакция
цикла - окисление изолимонной кислоты, катализируемая
изоцитратдегидрогеназой, представляет особый интерес, поскольку является
лимитирующей для ЦТК в целом. Многие микроорганизмы содержат два типа
изоцитратдегид-рогеназ - НАД- и НАДФ-зависимые. Однако роль катализатора
окисления изоцитрата играет только НАД-зависимый фермент, в то время как
НАДФ-зависимый участвует в различных вспомогательных процессах ЦТК.
Образующийся в результате этой реакции а-кетоглутарат окисляется а-
кетоглутаратдегидрогеназой (аналогично пируватдегидрогеназ-ной реакции) в
янтарную кислоту. Последняя с помощью сукцинатде-гидрогеназы окисляется в
фумаровую кислоту. Гидратация фумаровой кислоты, осуществляемая
фумаразой, приводит к образованию яблочной кислоты. Дальнейшее окисление
яблочной кислоты малатде-гидрогеназой приводит к регенерации ЩУК -
начальному акцептору активного ацетата. За исключением реакции окисления
а-кетоглута-рата в сукцинил-КоА, любая из реакций ЦТК легко обратима.
Углеродные атомы ацетата в ходе ЦТК освобождаются в виде углекислоты в
реакциях окислительного декарбоксилирования изолимонной и а-
кетоглутаровой кислот, а восемь атомов водорода, образующихся в процессах
дегидрирования субстратов ЦТК специфическими дегидрогеназами,
присоединяются к коферментам (шесть к НАД+ и два - к ФАД"^). При аэробном
дыхании эти атомы водорода в конечном счете связываются с кислородом с
образованием воды. Однако до этого они перемещаются вдоль цепи молекул-
переносчиков, составляющих цепь переноса электронов, или дыхательную
цепь. Перенос электронов по дыхательной цепи сопряжен с образованием
макроэр-гических (богатых энергией) фосфатных связей в результате
окислительного фосфорилирования. На каждую молекулу окисленного пиру-вата
образуется 15 макроэргических фосфатных связей, т. е. эффективность
данного процесса составляет 66%.
Ферменты, катализирующие реакции ЦТК, обнаружены в экстрактах мицелия
ряда грибов, однако полным набором ферментов, необходимых не только для
всех реакций ЦТК, но и для переноса электронов к кислороду, обладают
только митохондрии или аналоги этих субклеточных структур.
V.10.2.4. ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ЦИКЛ [51, 144, 208, 260, 478]
Существует целый ряд вспомогательных ферментативных реакций, в результате
которых промежуточные метаболиты выводятся из циклов. Эти реакции
называются анаплеротическими. Анаплеротическую
217
функцию выполняет и так называемый глиоксилатный цикл, характерный для
грибов. В тех случаях, когда ацетат или другое двухуглеродное соединение
используется не только в качестве источника энергии, но и источника
промежуточных метаболитов, как правило, вместо классического ЦТК
функционирует глиоксилатный цикл (рис! 95).
Ключевыми ферментами этого цикла являются изоцитратлиаза, катализирующая
расщепление изолимонной кислоты на янтарную и глиоксиловую, и малат-
синтаза, осуществляющая присоединение гли-оксиловой кислоты к ацетил-КоА
с образованием яблочной кислоты
HS-KoA
Цисаконитат нго
Сукцинат
I
Фумарат
Изоцитрат
- Ma/iam
ЩУК А ЦТК 1
Рис. 95. Глиоксилатный цикл:
1 - цитрат-синтаза; 2, 3 -аконитаза; 4 - изоцитратлиаза; 5 -
малатсинтаза; 6 - малатдегидрогеназа.
Помимо этих ферментов для нормального функционирования цикла необходимо и
одновременное участие еще трех ферментов ЦТК: цитрат-синтазы, аконитазы и
малатдегидрогеназы и наличие цепи переноса электронов для окисления
восстановленного НАД. В результате одного оборота цикла окисляются две
молекулы ацетил-КоА и образуется одна молекула янтарной кислоты, которая
используется в процессах синтеза углеводов.
Таким образом, глиоксилатный цикл поставляет для различных процессов
биосинтеза как энергию, так и четырехуглеродные промежуточные продукты.
Считается, что для пополнения ЦТК во время превращений глюкозы, а также
пирувата и других С3-соединений глиоксилатный цикл, по-видимому, не
играет существенной роли.
Ферменты глиоксилатного цикла обнаруживаются в бесклеточных экстрактах
различных грибов.
V.10.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА
Метаболическую функцию ферментов определяют по их максимальной
активности. При этом следует учитывать, что промежуточные метаболиты
содержатся в клетке в субоптимальных концентрациях, что не позволяет
отдельным ферментам функционировать с максималь-
218
ной скоростью, а некоторые метаболиты являются общими для нескольких
путей превращения углеводов или выполняют регуляторную функцию. В связи с
этим, прежде чем сделать заключение о роли того или иного цикла в
жизнедеятельности исследуемого организма, необходимо провести тщательный
анализ данных, учитывая не только активность отдельных ферментов, но и
содержание промежуточных метаболитов. Окончательное же заключение об
удельной активности отдельных путей метаболизма углеводов можно сделать
на основании данных радиореспирометрических исследований.
Исследования по определению активности ферментов, участвующих в
