Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 97

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 91 92 93 94 95 96 < 97 > 98 99 100 101 102 103 .. 279 >> Следующая

обладающие и не обладающие специфичностью к углеводу в НК: ДНКазы,
РНКазы-гидролазы и неспецифичные нуклеазы. Истинные РНКазы являются
эндонуклеазами, т. е. расщепляют внутренние фосфодиэфирные связи в РНК.
Отличительной чертой их является также то, что они не нуждаются в ионах
двухвалентных металлов в качестве активаторов. РНКазы проявляют более или
менее выраженную специфичность к основаниям, примыкающим к разрываемой
фосфодиэфирной связи. На основании этого их делят на три основные группы:
1) пиримидинспецифичные РНКазы (К.Ф.3.1.4.22) (рекомендуемое
классификацией 1972 г. рабочее название - "рибонуклеаза I");
2) гуанинспецифичные РНКазы (К.Ф.3.1.4.8) (рекомендуемое классификацией
1972 г. название - "гуанилорибонуклеаза"; систематическое название-
"рибонуклеат-З'-гуанилоолигонуклеотидогидролаза"):
3) неспецифичные РНКазы (К.Ф.3.1.4.23) (рекомендуемое классификацией 1972
г. название - "рибонуклеаза II"; систематическое название - "рибонуклеат-
З'-олигонуклеотидогидролаза").
Грибы образуют и выделяют в окружающую среду кислые - неспецифичные и
щелочные - высокоспецифичные РНКазы. Касаясь таксономического положения
грибов - продуцентов РНКаз, нужно подчеркнуть, что способность
продуцировать гуанинспецифичные РНКазы с низкой молекулярной массой
присуща зигомицетам, аскомице-там, несовершенным грибам и базидиомицетам.
Кислые РНКазы образуют не только истинные грибы, но и миксомицеты [21,
25].
Фосфогидролазы подразделяют на экзонуклеазы, расщепляющие субстраты с
концов поли нуклеотидных цепей, и эндонуклеазы, разрывающие внутренние
межнуклеотидные связи [23]. Эти две группы ферментов включают РНКазы-
гидролазы, специфичные к РНК, ДНКазы и собственно нуклеазы. По
современной классификации ферментов нуклеазы отнесены к следующим
систематическим группам:
1 .Фосфогидролазы ортофосфатных диэфиров (К.Ф.3.1.4.1) - экзонуклеазы,
специфичные и неспецифичные к углеводу в НК.
2. Олигонуклеотидгидролазы дезоксирибонуклеиновых кислот (К.Ф.3.1.4.5;
К.Ф.3.1.4.6) - ДНКазы-эндонуклеазы.
3. Эндонуклеазы (К.Ф.3.1.4.7; К.Ф.3.1.4.9) включают неспецифичные к
углеводу нуклеазы и РНКазы-гидролазы, осуществляющие внут-рицепочечное
расщепление НК.
203
У.8.2. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ Н/КЛСаЗ
Среды для поверхностного культивирования (время культивирования 1-2 нед.
при температуре 24° С):
Агаризованная среда Чапека
Состав % Состав %
Сахароза 3,0 КС1 0,05
NaN03 0,2 FeS04 0,001
КН2Р04 0,1 Агар-агар 1,5-2,0
MgS04*7H20 0,05
"Косячки" желательно хранить при 4° С.
Среды для глубинного культивирования грибов:
Состав Среда Огата, % Видоизмененная среда [23], %
Глюкоза 5,0 5,0
Пептон 0,5 1,0
Соевая мука 0,5 0,5
MgS04.7H20 СаС12"2Н20 0,05 0,05
0,01 0,01
KN03 0,2 0,2
Бычий экстракт 0,5 -
Дрожжевой экстракт 0,2 -
pH среды до стерилизации должен быть около 6,2; после стерилизации - 5,7-
5,9. Стерилизацию проводят 30 мин при давлении 0,5 атм. Видоизмененная
среда Огата по своему составу в основном отвечает потребностям
большинства сапрофитных грибов. Она не содержит минерального фосфата, что
очень существенно для синтеза и секреции ферментов катаболизма НК [148,
531, 613].
Дрожжи можно выращивать на свободной от ортофосфата среде, содержащей
2,5% глюкозы, 0,1 мочевины и 0,5% освобожденного от ортофосфата
дрожжевого экстракта [531].
Помимо жидких питательных сред для глубинного культивирования при поиске
продуцентов нуклеаз все еще используют твердые среды. Так, рекомендуют
[591] культивировать грибы рода Penicillium на влажных пшеничных отрубях
(8 г отрубей увлажняют 5 мл воды) при 28° С 2 дня и затем при 20° еще 3
дня. Активность нуклеаз измеряют в водном экстракте полученного материала
после концентрирования его высаливанием сульфатом аммония и диализа.
При отборе культур, обладающих способностью гидролизовать РНК, также
используют твердые питательные среды. В ряде случаев они отличаются от
жидких сред лишь тем, что в их состав введена РНК или рибонуклеат натрия
(PHK-Na) (0,4%) и агар (1,5-2,0%).
После выращивания соответствующих культур в термостате на поверхность
агара в чашках Петри наносят 1 н. раствор НС1 для осаждения
нерасщепленной РНК. Зоны просветления вокруг областей роста колоний
указывают на гидролиз РНК. Аналогичные данные могут быть получены с
введением в состав сред ДНК.
Некоторые грибы продуцируют внеклеточные ДНКазы при росте на
видоизмененной среде Огата [367], состав которой приведен выше*
204
V.8.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РИБОНУКЛЕАЗ
Активность РНКаз определяют спектрофотометрическим методом, используя в
качестве субстрата натриевую соль дрожжевой РНК, приготовленную следующим
образом: дрожжевую РНК (Олайненский завод) растворяют в 0,5 н. растворе
NaOH (pH < 8), диализуют в целлофановом мешочке против дистиллированной
воды (2 сут) и 0,01 М раствора ЭДТА (1 сут), затем осаждают 2,5 объемами
этанола после добавления 0,1 объема 20%-ного раствора ацетата натрия.
После отстаивания в течение суток на холоду осадок отделяют фильтрованием
Предыдущая << 1 .. 91 92 93 94 95 96 < 97 > 98 99 100 101 102 103 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed