Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
грибов, вокруг которых образуются зоны задержки роста тест-организма.
IX.2.4. ОБОГАЩЕНИЕ ПОЧВЫ
Почву, из которой предполагают выделить антагонист, обогащают
микроорганизмами тех видов, по отношению к которым хотят получить
антагонист. Через определенные сроки (бактерии - через сутки, грибы -
через 3-5 сут) почву высевают в виде отдельных комочков на агаровые
пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же
микроорганизмом, который был использован для обогащения почвы.
IX.3. ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ-АНТАГОНИСТОВ
После выделения гриба-антагониста в чистую культуру определяют его
видовую принадлежность и приступают к изучению антибиотических свойств по
отношению к различным тест-микробам: сапрофитным и патогенным формам,
грамположительным, грамотрицатель-ным, спорообразующим микроорганизмам,
гифальным, дрожжевым грибам, вирусам.
IX.3.1. ВЫБОР ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМОВ
Чем шире набор тест-объектов, тем перспективнее выявление антагонистов с
нужными свойствами. Тест-организмы играют большую роль при дальнейшей
работе с антагонистом и при выделении антибиотика. Поэтому выбирается
тест-микроб, наиболее чувствительный к данному антибиотику. При
установлении антимикробных спектров необходимо помнить о том, что
различные штаммы одного вида тест-микроорганизма проявляют различную
чувствительность к одному и тому же антибиотическому препарату. Поэтому
культуры, используемые в качестве тестов, следует обозначать точным
названием вида и штамма. Это требование необходимо строго соблюдать,
особенно в тех случаях, когда антимикробный спектр приводится как одна из
характеристик вновь описываемых антибиотиков.
В настоящее время разработаны биологические методы качественного и
количественного определения антибиотических свойств грибов на стадии
культуральной жидкости и физико-химические методы учета антибиотической
активности препаратов антибиотиков [66, 119, 136, 146, 457, 474, 480].
IX.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПЛОТНЫХ СРЕДАХ
При поиске продуцентов антибиотиков выделенные культуры антагонистов чаще
всего испытывают на плотных питательных средах.
271
IX.3.2.1. МЕТОД АГАРОВЫХ БЛОКОВ
Гриб-антагонист высевают на агаризованную среду Чапека или сусло в чашку
Петри. После того как антагонист хорошо вырастет, пробочным сверлом
(диаметр 8 мм) вырезают агаровые блоки из колоний гриба и переносят их на
поверхность другой агаровой пластинки, предварительно засеянной одним из
тест-микроорганизмов. Чашки с агаровыми блоками помещают в термостат на
20-24 ч при температуре, оптимальной для развития тест-культуры. Если
выделяемый грибом антибиотик подавляет рост тест-микроба, то вокруг
агарового блока образуется зона отсутствия роста.
В центр чашки Петри помещают по одному блоку, вырезанному из колонии
гриба-антагониста, затем в чашку наливают питательный агар, пригодный для
развития тест-микробов, с таким расчетом, чтобы уровень агара был на 1-2
мм ниже уровня блока. Затем по радиусам агаровой пластинки высевают
штрихами тест-организмы и чашки помещают на 20-24 ч в термостат.
Отсутствие роста штриха тест-культуры на определенном расстоянии от блока
указывает на угнетение ее антибиотиком, образуемым изучаемым грибом-
антагонистом.
IX.3.2.2. МЕТОД ДВОЙНЫХ ПЛАСТИНОК
Чашку Петри делят стеклянной перегородкой пополам. В одну половину вносят
питательный агар с антагонистом, другую заливают стерильным агаром. После
этого на поверхность агара штрихами наносят тест-организмы. Метод штриха
дает возможность определить антибиотическую активность гриба-антагониста
по отношению к нескольким тест-организмам. Если антагонист (гриб) или
тест-культура (бактерия) требуют различных сред и температурного режима
для своего развития, необходимо пользоваться методом двойных агаровых
пластинок.
IX.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ЖИДКИХ СРЕДАХ
Грибы-антагонисты культивируют при температуре 26-28° С поверхностным
(10-15 дней) или погруженным (3-4 дня) методом.
При определении антибиотических свойств грибов, выращиваемых на
жидких питательных средах, необходимо иметь в виду, что некоторые
антибиотики (гризеофульвин, мицелианамид и др.) накапливаются в мицелии
продуцента и практически не выделяются в питательную среду. Поэтому для
оценки антибиотической активности гриба следует изучать антибиотические
свойства как культуральной жидкости, так и экстрактов из мицелия.
Рис. 104. Изучение антибиотической активности культуральных жидкостей
грибов методом бумажных дисков.
272
1Х.З.Э.1. МЕТОД БУМАЖНЫХ ДИСКОВ
Диски из фильтровальной бумаги, смоченные в испытуемых культуральных
жидкостях или экстрактах из мицелия гриба, накладывают на поверхность
питательного агара, засеянного тест-организмом .Чашки помещают в
термостат при температуре, оптимальной для роста тест-микроба, на 24 ч
(если тест-организм - бактерии) или на 48- 72 ч (если тест-организм -
грибы или дрожжи). При наличии в испытуемом растворе антибиотика вокруг
