Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
мл культуральной жидкости. Если наблюдается рост Е. coli в контрольных
пробирках, где витамин разрушен, то находят по калибровочной кривой
соответствующие росту значения, которые вычисляют по количеству витамина
в пробах, в которых витамин не разрушен [246].
VIII.3.2. БИОАВТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Биоавтографический метод используют для исследования образцов, которые
содержат значительное количество аналогов витамина В12. Этот метод
позволяет установить присутствие неактивных форм витамина. При
биоавтографическом определении сначала проводят хроматографический анализ
пробы, затем полоску хроматограммы помещают в среду, засеянную культурой.
Гидролизат или культуральную жидкость, используемые для количественного
определения общего содержания кобаламина микробиологическим методом,
изучают также методом хроматографии для определения истинного витамина
В12 (цианкобаламина). Для хроматографического анализа используют полоски
бумаги шириной 0,5 см и растворитель следующего состава: 100 мл бутанола;
1 мл концентрированного аммиака; 2,5 мл 1%-ного раствора цианистого
калия; 50 мл дистиллированной воды. Хроматография длится 20-40 ч при
температуре 37° С. Метчик витамина (0,1 мкг/мл - не менее 0,001 мкг/мл)
наносят в количестве 0,005- 0,01 мл. Высушенную полоску хроматограммы
помещают на поверхность агаризованной среды, засеянной индикаторной
культурой. Инкубируют в термостате при 37° С в течение 18 ч. Зоны роста
имеют удлиненную форму. Расчет производят по таблицам, предложенным
Н. Д. Иерусалимским [180]. По метчику витамина определяют содержание
истинного витамина В12 в пробе.
VIII.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНА
Для определения рибофлавина применяют флюорометрический метод [360, 425],
поскольку растворы рибофлавина в воде и некоторых других растворителях
при освещении УФ-светом дают яркую желто-зеленую флюоресценцию,
интенсивность которой пропорциональна концентрации рибофлавина. Максимум
флюоресценции рибофлавина - 535 нм.
267
VIII.4.1. ОСВОБОЖДЕНИЕ СВЯЗАННЫХ ФОРМ РИБОФЛАВИНА ИЗ МИЦЕЛИЯ И ИХ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Связанные с белком моно- и динуклеотиды рибофлавина не обладают
флюоресценцией. Для образования свободных флюоресцирующих форм
рибофлавина необходимо разрушить эту связь. Разрыв связи мононуклеотидов
с белком обычно достигается кислотным гидролизом, а для расщепления
динуклеотидов применяют фосфатазные препараты. У грибов, растений и
других организмов обнаружена форма рибофлавина, прочно связанного с
белком не через фосфорную кислоту, а посредством пептидных связей, для
разрушения которых требуется протеолиз, осуществляемый протеолитическими
препаратами (трипсином, панкреатином). При определении связанных форм
рибофлавина у грибов проводят обработку образцов трипсином с последующим
гидролизом ТХУ.
К навеске сухого мицелия (20-30 мг) прибавляют 2 мл фосфатного буфера (pH
7,8-8,0), выдерживают в кипящей бане 45 мин, затем охлаждают до 30° С,
добавляют трипсин (1 мг) и помещают в термостат при 37° С на 17 ч. Затем
приливают 2 мл 20%-ного раствора ТХУ и кипятят 10 мин. В остывшие пробы
добавляют */4 объема 4 М раствора К2НР04 (1 мл), при этом pH смеси должно
составлять 5,5-6,0, доводят объем до 10 мл и отфильтровывают. Фильтрат (5
мл) окисляют перманганатом калия, для чего прибавляют 4%-ный раствор
КМп04 до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 5 мин. Спустя
5 мин прибавляют по каплям 3%-ный раствор перекиси водорода до
исчезновения окраски и доводят объем до 10 мл дистиллированной водой. В
случае выпадения осадка раствор фильтруют и затем флюо-рометрируют.
V111.4.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОФЛАВИНА В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ жидкости
К 4 мл культуральной жидкости гриба прибавляют 1 мл К2НР04 (pH смеси
6,0), несколько капель 4%-ного раствора КМп04, спустя 5 мин несколько
капель перекиси водорода, доводят объем раствора до 10 мл, фильтруют и
флюорометрируют, гасят флюоресценцию небольшим количеством соды (NaHC03)
и гидросульфита натрия (Na2S204) и снова флюорометрируют. По разнице
между первым и вторым определением и находят истинную флюоресценцию
рибофлавина. Контроль-раствор рибофлавина. Для приготовления основного
раствора рибофлавина (40 мкг/мл) 10 мг витамина растворяют в 250 мл
дистиллированной воды. Хранят в холодильнике. Раствор сохраняет стойкость
в течение месяца. Непосредственно перед определением готовят рабочий
стандартный раствор, содержащий 0,4 мкг рибофлавина в 1 мл.
Расчет содержания рибофлавина производят по формуле (А-Б) х Х0,4
ц/ВР(мкг/г вещества), где А-показания флюорометра для испытуемого
раствора; Б - показания фолюорометра для испытуемого раствора после
гашения; В - показания флюорометра для стандартного раствора; Р - навеска
мицелия (г); v - общее разведение пробы (мл).
IX. ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ
IX.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Антибиотики - специфические продукты жизнедеятельности любой живой
нормальной клетки (микробного, растительного, животного происхождения),
обладающие высокой физиологической активностью по отношению к
