Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
бумажного диска образуется зона задержки роста тест-микроба (рис. 104).
IX.3.3.2. МЕТОД ЖЕЛОБКА
В питательном агаре, разлитом в чашки Петри, вырезают желобок, который
заполняют культуральной жидкостью продуцента-ан-тибиотика вместе с
расплавленным агаром. Перпендикулярно желобку наносят штрихи тест-
микробов.
IX.3.3.3. МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ
В модификации [455] метод используется для изучения фунгиста-тических и
фунгицидных свойств микромицетов на стадии культуральных жидкостей по
отношению к фитопатогенным грибам (головневым и мучнисторосяным).
1. Хламидоспоры и оидии фитопатогенных грибов проращивают в капле
культуральной жидкости грибов-антагонистов (разведения 1 : 10; 1 : 100; 1
: 1000), нанесенных на внутреннюю поверхность перевернутых чашек Петри,
на крышки которых (служащие дном) наливают стериль-
С
Рис. 105. Изучение фунгистатических свойств антибиотиков методом
проращивания тест-грибов в висячих каплях, нанесенных на внутреннюю
поверхность крышек чашки Петри:
/ - висячие капли антибиотиков (в разведении); 2 - крышка чашки Петри; 3
- дно чашки Петри; 4 - стерильная вода для создания влажной камеры.
Рис. 106. Проращивание тестмикробов в висячих каплях:
/ - чашка Петри; 2 - фильтровальная бумага; 3 - луночки; 4 - покровные
стекла; 5 - висячие капли антибиотиков (в разведении).
ную водопроводную воду для создания влажной камеры (рис. 105).
2. Хламидоспоры и оидии фитопатогенных грибов проращивают в висячих
каплях культуральных жидкостей микромицетов, которые наносят на покровные
стекла. Затем стекла размещают над лунками в фильтровальной бумаге,
которая в восемь слоев выстилает дно чашки Петри (рис. 106).
Пользуясь этими методами, можно, не нарушая стерильности опыта, наблюдать
под микроскопом ингибицию прорастания спор фитопатогенных грибов в
исследуемых препаратах антибиотиков [456].
273
Учет опыта производят по количеству проросших хламидоспор или оидий (в
процентах) в шести полях зрения микроскопа после 24-часовой инкубации их
в каплях культуральных жидкостей и стерильной водопроводной воды
(контроль) при температуре 26-28° С.
IX.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Для количественного определения содержания антибиотиков в культуральных
жидкостях, экстрактах, растворах на всех стадиях изучения антибиотиков
применяют биологические, химические, физико-химические и другие методы.
Биологические методы количественного определения антибиотиков основаны на
избирательном действии антибиотика на клетки культуры тест-организма
[119, 146, 147, 455].
IX.4.1. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ
IX.4.1.1. НА ЖИДКОЙ СРЕДЕ
Культуральную жидкость или раствор антибиотиков разводят стерильной
дистиллированной водой в 2, 4, 8, 16, 32, 68 и т. д. раз; 1 мл жидкости
каждого разведения смешивают с 1 мл питательного бульона и засевают одной
или двумя каплями тест-организма (нагрузка тест-культуры - 200 ООО
микробных тел в 1 мл питательной среды). Антибиотическое действие
испытуемых растворов антибиотиков определяют по степени развития тест-
культур после 18-24-часовой инкубации их при оптимальной температуре.
Бактериостатическое действие учитывают визуально, бактерицидное -
высевами через 24 ч на плотные среды.
IX.4.1.2. НА ПЛОТНОЙ СРЕДЕ
Метод аналогичен методу серийных разведений на жидкой среде с той лишь
разницей, что 1 мл культуральной жидкости определенного разведения или
раствора препарата антибиотика смешивают с 1 мл расплавленного
питательного агара, перемешивают и оставляют в наклонном положении до
затвердения агара. Затем наносят узкой полоской тест-организм и через
сутки инкубации в термостате определяют титр антибиотика в испытуемом
образце. Определение антибиотической активности методом серийных
разведений на плотных питательных средах можно проводить в пробирках и
чашках Петри. Преимущество чашечного метода по сравнению с пробирочным
состоит в том, что в первом случае каждое разведение изучаемого препарата
может быть испытано одновременно по отношению к нескольким тест-микробам.
Методом серийных разведений определяют количество антибиотика не только в
условных единицах разведения, но и в весовых или стандартных единицах
того или иного антибиотика.
IX.4.2. МЕТОД ДИФФУЗИИ В АГАР
Диффузионные методы количественного определения антибиотиков основаны на
способности антибиотических веществ диффундировать в агаризованных средах
и образовывать зоны, в которых не развиваются тест-микроорганизмы.
274
IX.4.2.1. МЕТОД ЦИЛИНДРОВ
На поверхность питательного агара в чашках Петри расставляют
металлические цилиндры (с внешним диаметром 8 мм, внутренним - 6 мм и
высотой 10 мм) из алюминия или нержавеющей стали. Используют двухслойный
питательный агар, второй слой которого содержит суспензию тест-организма
в определенной концентрации. В одни цилиндры вносят испытуемый раствор
антибиотика, в другие - стандартный раствор того же антибиотика. После
24-часовой инкубации при температуре, оптимальной для развития тест-
