Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Микробиологический метод основан на применении ауксогетеро-трофных
микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов), утративших способность
синтезировать тот или иной витамин или сразу несколько. Такие
микроорганизмы являются индикаторными культурами.
261
VIII.2.1. ИНДИКАТОРНЫЕ КУЛЬТУРЫ
Для определения витаминов используют дрожжевые индикаторные культуры,
обладающие высокой чувствительностью, они реагируют на определенные
витамины и малочувствительны к другим биологически активным веществам
грибов.
1. Debaryomyces disporus - индикатор на пиридоксин, тиамин и его
связанную форму - кокарбоксилазу. Debaryomyces disporus нуждается в
пиридоксине, тиамине и частично инозите. Реагирует усилением роста при
добавлении 0,000032 мкг пиридоксина, 0,0004 мкг тиамина на 1 мл
питательной среды.
2. Fabospora fragilis - индикатор на никотиновую кислоту. Эта культура не
синтезирует никотиновой кислоты, биотина и частично нуждается в
пантотеновой кислоте и тиамине, реагирует на добавление 0,0005 мкг
никотиновой кислоты на 1 мл питательной среды.
3. Candida tropicalis СК-4 - индикатор на биотин. Нуждается только в
биотине и не требует внесения других витаминов в питательную среду [1].
4. Saccharomyces ludwigi - индикатор на пантотеновую кислоту
Индикаторные культуры сохраняют на сусло-агаре при температуре 0-5° С и
пересевают каждые 20 дней.
VIII.2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ВИТАМИНОВ
Для постановки опыта по микробиологическому определению биотина, тиамина,
никотиновой кислоты, пиридоксина, пантотеновой кислоты используют среду
Ридера следующего состава (г/л):
Растворы фосфатов и глюкозы готовят отдельно на дистиллированной воде,
растворы других солей - на прокипяченной, отфильтрованной водопроводной
воде. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Растворы фосфатов и солей перед опытом смешивают, вносят стерильно
глюкозу. Опыт проводят на среде Ридера с добавлением всех необходимых для
применяемой индикаторной культуры витаминов, за исключением
определяемого. Концентрация вносимых в среду витаминов составляет
(мкг/мл): для определения тиамина - 1,0 инозита и 0,1 пиридоксина; для
определения пиридоксина- 1,0 инозита и 0,1 тиамина; для определения
никотиновой кислоты - 0,0001 биотина, 0,1 пантотеновой кислоты и 0,1
тиамина; для определения пантотеновой кислоты - 5,0 тиамина и
пиридоксина, 0,002 биотина и 3,0 инозита. Среду засевают 2-суточной
индикаторной культурой, выращенной на сусло-агаре при температуре 27° С,
смытой физиологическим раствором и содержащей 20 000 клеток/мл (подсчет в
камере Горяева). Для засева используют 0,05 мл микробной взвеси. Культуру
можно
[3661.
Сернокислый аммоний Магний сернокислый Натрий хлористый
Калий фосфорнокислый (однозамещенный) Калий фосфорнокислый
(двузамещенный) Глюкоза Агар-агар
3
0,7
0,5
1,0
0,1
20,0
20,0
262
вносить из данного расчета в определенный объем среды. Для проведения
качественного определения витаминов используют агаризованную среду
Ридера.
VIII.2.3. КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Определяют способность к образованию витаминов по наличию зон роста
индикаторных культур вокруг дисков мицелия или цилиндриков с
культуральной жидкостью или экстрактом мицелия. Грибы выращивают в
течение 10 сут при 28° С на агаризованной среде Чапека, в чашках Петри. С
газона культуры гриба вырезают блок размером 10 X 10 мм и наносят на
поверхность агаризованной среды Ридера с посеянной индикаторной культурой
на определяемый витамин. По 150 мл среды Ридера разливают в кюветы из
органического стекла размером 30 X 25 см. Выращивая грибы на жидких
питательных средах (при поверхностном культивировании в течение 10-15
сут, при по-
1Индикаторная культура:
(48-часовая]
JDebaruomyces disporus-тиамин, пиридоксин fabospora fragiUs- никотиновая
кислота saccharomyces Ludmgi-пантотеновая кислота Candida tropicalis-
биотин
Количественное определения в мицелии
(навеска сух. м. 20-50мг]
Кислотный гидролиз тиамин-0,1 H.HzS0if-
пиридоксин и никотиновая кислота-1н. НгS04 биотин -6н. H2S0i, J
пантотеновая кислота -протеаза((18ч; 45 °С]
Нейтрализация 0,1-1-6 %-ным NaOH. соответственно ¦
в фильтрате культуральной жидкости Ш-0,2мл)
Кипячение (45 мин]
г
1 атм
гидролизатов - Н5; N10
Качественное определение 4^7° Блок
б о// с мицелием*
5.1
/в а
Коч
й
жидкость IW
lb-суточная
культура
3-суточная культура
4-су точная культура
48 4В 4
5.2 Ж~(r)1
fiS:
Культивирование 48 ч при 28 °С
Рис. 102. Схема определения витаминов микробиологическим методом на
примере исследования фузариев в процессе роста на жидкой питательной
среде:
1 - среда Ридера (жидкая) с внесенной индикаторной культурой на
определяемый витамин и необходимыми витаминами для роста данной
индикаторной культуры; 1.1 - среда Ридера (контроль); 1.2 - среда Ридера
с гидролизатом (0,1- 0,2 мл); 1.3 - среда Ридера с культуральной
жидкостью (0,1-0,2 мл); 1.4 - среда Ридера с различными концентрациями
витамина (стандартные растворы); 2 - чашка Петри с культурой гриба,
