Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
процессов.
IX.9.1. ИНГИБИТОРЫ СИНТЕЗА КЛЕТОЧНОЙ
ОБОЛОЧКИ БАКТЕРИЙ
К этой группе относят пенициллины, цефалоспорины, циклосерин, бацитрацин
и другие антибиотики, которые обладают высокой антибиотической
активностью по отношению к грамположительным бактериям. Антибиотики
избирательно ингибируют синтез клеточной стенки бактерий, что приводит к
изменению формы бактериальных клеток (удлинение, набухание, образование
длинных цепочек и шаров) и нарушению направленности биохимических
процессов (накопление в
282
протоплазме клеток низкомолекулярных соединений - производных уридин-5-
пирофосфата, N-ацетилмурамовой кислоты, пептида с определенной
последовательностью аминокислот).
Микроскопическими методами изучают изменения морфологии чувствительных к
соответствующим антибиотикам клеток бактерий, химическими - изменения
характера синтеза и выделения "структурных единиц", из которых построены
полимеры клеточных стенок.
IX.9.1.1. ПОЛУЧЕНИЕ СФЕРОПЛАСТОВ ИЗ КЛЕТОК
КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕНИЦИЛЛИНА
Бактерии инкубируют при встряхивании в МПБ с 20% сахарозы, 0,2%
сернокислого магния и 100-1000 мкг/мл пенициллина при температуре 37°С
[395]. Синтез клеточных стенок прекращается, а растущая протоплазма
образует сферы, окруженные цитоплазматической мембраной. В течение 2 ч
практически все клетки превращаются в сферо-пласты, что легко наблюдать с
помощью фазово-контрастной микроскопии. Если сферопласты отмыть от
пенициллина и продолжать их культивирование в гипертонической среде, они
превращаются в обычные палочковидные формы, что указывает на сохранение в
цитоплазматической мембране ферментных систем, синтезирующих полимеры
клеточной стенки.
IX.9.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРИДИННУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКАХ
СТАФИЛОКОККА, КУЛЬТИВИРУЕМОГО НА СРЕДЕ С ПЕНИЦИЛЛИНОМ
Клетки золотистого стафилококка, находящиеся в логарифмической фазе
роста, инкубируют в питательной среде с пенициллином, после чего отделяют
от среды и экстрагируют холодной 10%-ной ТХУ. После частичной очистки
экстракта и удаления ТХУ количество ури-диннуклеотидов определяют по
модифицированной реакции Элсо-на - Моргана на аминосахара [395].
Накопление уридиннуклеотидов заканчивается через 1-2 ч, причем их
количество повышается за это время в 50-100 раз по сравнению с исходным.
Масса вновь обнаруженных метаболитов в максимальной точке накопления
может составлять до 10% всей сухой бактериальной массы.
Антибиотики из актиномицетов изучены как ингибиторы синтеза белка и НК.
Ниже кратко изложены эти сведения.
IX.9.2. ИНГИБИТОРЫ СИНТЕЗА БЕЛКА
В эту группу включают антибиотики - хлоромицетин, стрептомицин,
эритромицин, олеандомицин, которые ингибируют синтез белка, не разрушая
синтеза НК. Действие антибиотиков - ингибиторов белкового синтеза было
подтверждено разными учеными [104, 114, 395] с помощью различных методов
на разных видах микроорганизмов [79, 104, 114, 395] в инкубационных
смесях и бесклеточных системах [104, 114, 119, 395].
Среди антибиотиков этой группы наиболее полно изучен хлоромицетин,
высокая избирательность действия которого на белковый синтез позволяет
использовать его для разобщения процессов синтеза высокомолекулярных
соединений. Поскольку синтез НК уже сформированными ферментными системами
не подавляется антибиотиком, хлоромицетин используется для выявления
механизма, контролирующего синтез РНК и ДНК.
283
Хлоромицетин нашел применение при исследовании процессов трансформации
или трансдукции микробной клетки, при изучении системы фаг - хозяин.
Антибиотик нарушает белковый синтез на стадии переноса аминокислот от
аминоацил-РНК к синтезируемой белковой молекуле. Показателем ингибиции
синтеза белка под влиянием хлоро-мицетина является изменение прочности
связи 14С-меченых аминокислот с тРНК. Антибиотик тормозит включение в
белки всех испытанных аминокислот.
IX.9.2.1. ДЕЙСТВИЕ ХЛОРОМИЦЕТИНА НА ВКЛЮЧЕНИЕ
В БЕЛКИ АМИНОКИСЛОТ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ
ИЗ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ (ПО РЭНДИ И ОЧОА) [395]
0,5 мл каждого образца содержит (мкмоль) : 100 хлористого калия; 50 Трис-
HCl буфера, pH 7,8; 5 хлористого магния; 40 меркаптоэтано-ламина; 0,25
АТФ; 0,04 ГТФ; 6,7 фосфокреатина; 25 мкг креатинки-назы; 0,0614С-меченой
аминокислоты (10 мкКи/мкмоль); концентрация
каждой из 19 немеченых аминокислот - 0,3 ммоля. Образец инкубируют 15 мин
при температуре 37° С. Рибосомы кишечной палочки промывают 0,02 М
раствором Трис-HCl буфера (pH 7,9), содержащим 0,01 моля хлористого магни
я (табл. 20).
IX.9.3. ИНГИБИТОРЫ СИНТЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Эти антибиотики включают актиномицины, митомицины, но-вобиоцин, которые
ингибируют синтез messenger-PH К (РНК-посредника) и вступают во
взаимодействие с ДНК клеток. В связи с противоопухолевой активностью
актиномицинов действие их на процессы метаболизма изучают не только на
микробных клетках, но и на опухолевых и нормальных клетках млекопитающих,
а также в бесклеточных ферментных системах, отдельные компоненты которых
имеют различное происхождение [104, 114, 395].
