Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 128

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 279 >> Следующая

0,004-0,5 пиридоксина. Содержание витамина в образцах определяют с
помощью стандартных кривых кристаллического витамина (см. рис. 103).
Затем производят пересчет на 1 г абсолютно сухого мицелия или на 1 мл
культуральной жидкости.
Пересчет на 1 г сухой массы мицелия:
0,00004 - a a а • 1 1 Г _ х х ~ 0,00004 '
где а - количество витамина в гидролизате, определенное по калибровочной
кривой витамина; 0,00004 - постоянная величина, соответствующая
количеству сухого мицелия (г) в 1 мл среды Ридера при навеске мицелия 20
мг и разведении гидролизата до 10 мл.
VIII.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В12 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Микробиологический метод позволяет качественно или количественно оценить
содержание витамина В12 и различных его аналогов.
Микромицеты выращивают на среде Чапека с солями кобальта. Для
качественного определения можно использовать и агаризован-ную среду
Чапека. Качественное определение витамина В12 проводят аналогично
описанным выше методам определения витаминов группы В с учетом условий
роста индикаторной культуры (см. раздел VIII. 2.3). При этом используют
индикаторную культуру Escherichia coli 113-2, которая обладает
чувствительностью 0,005-5,0 мкг/мл и отзывчива на все формы витамина.
Штамм Е. сол1 113-2 выращивают на косяках агара (1% пептона; 4 - глюкозы;
0,5 - хлористого натрия; 3% агар-агара) при температуре 37° С в течение
24 ч. Хранят в холо-
265
дильнике и пересевают раз в месяц. Посевной материал для засева среды в
опыте готовят за сутки на основной питательной среде с витамином В12
(0,00005 мкг/мл), ставят в термостат при 37° С на 20 ч. Затем
бактериальную суспензию переносят в стерильные центрифужные пробирки и
центрифугируют 10 мин (3000 g). Жидкость сливают, а осадок суспендируют в
2 мл физиологического раствора. Бактериальную взвесь в физиологическом
растворе используют для засева среды из расчета 20 млн. клеток/мл среды.
Для определения витамина Bj2 используют основную питательную среду
следующего состава (г/л):
Калий фосфорнокислый (двузамещенный) 7,0
Калий фосфорнокислый (однозамещенный) 3,0
Натрий лимоннокислый 1,0
Магний сернокислый 0,1
Аммоний сернокислый 2,0
Натрий хлористый 0,5
Натрий азотистокислый 0,0001
Глюкоза 20,0
Дистиллированная вода 1 л
pH 6,8-7,0
Среду стерилизуют при давлении 1 атм. Глюкозу и фосфорные соли раздельно.
При чашечном (качественном) определении и биоавтографии в среду добавляют
20,0 г агар-агара.
Агаризованную среду стерилизуют в колбах объемом 150 мл. В теплую среду
(45° С ) вносят культуру Е. coli 113-3. Для лучшего проявления роста
индикаторной культуры на каждые 150 мл среды вносят 4 мл 5%-ного раствора
2,3,5-трифенилтетразолия хлористого, который способствует образованию
красного пигмента при росте E.coli [586].
VIII.3.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
Метод включает два этапа: построение стандартной кривой для чистого
витамина и испытание исследуемого образца (гидролизата, культуральной
жидкости, пробы на метионин). Поскольку в мицелии витамин частично
находится в свободной форме, а основное его количество связано с белком,
то предварительно гидролизуют мицелий цианистым натрием при pH 4-5.
Гидролиз можно проводить также 5%-ным раствором NaN02 при pH 4-5. Навеску
воздушно-сухого мицелия (150-300 мг) заливают 5 мл дистиллированной воды,
подкисленной 1 н. раствором серной или соляной кислоты, через 10 мин
добавляют 0,25 мл 5%-ного раствора NaNOa (pH 4-5). Смесь кипятят 30 мин,
отфильтровывают и в зависимости от предполагаемого количества витамина
разводят гидролизаты 2%-ным раствором лимоннокислого натрия до 5-10 мл и
используют для определения. Поскольку в гидролизатах мицелия и
культуральной жидкости может содержаться метионин, к которому
чувствителен штамм Е. coli 113-3, проводят контрольный анализ, разрушая
витамин щелочным гидролизом. Для этого 2 мл гидролизата или культуральной
жидкости смешивают с 2 мл 0,2 н. NaOH и кипятят в течение 20 мин на
водяной бане в колбе с обратным холодильником. После охлаждения раствор
нейтрализуют 1 н. раствором НС1 и разбавляют дистиллированной водой, как
и в опыте с неразрушенным витамином.
266
Для построения калибровочной кривой используют растворы витамина,
содержащие 0,1-0,00005 мкг/мл витамина, приготовленные в стерильных
условиях из стандартного раствора, содержащего 2 мкг/мл витамина,
хранящегося в холодильнике. К среде с индикаторной культурой добавляют
разные количества исследуемого раствора (гидролизата, культуральной
жидкости и контрольной пробы с разрушенным витамином В12), а в другие -
по 0,1 мл раствора витамина разной концентрации. Каждую пробу исследуют в
трех повторностях. К опытному образцу добавляют 0,1; 0,4; 0,6 мл
гидролизата или культуральной жидкости, инкубируют при температуре 37° С
и через 24 ч определяют интенсивность роста нефелометр и чески.
Содержание витамина в образцах определяют с помощью калибровочной кривой
витамина В12. Затем проводят пересчет на 1 г сухой массы мицелия или на 1
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed