Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
0,6-2,0 мг/г сухой массы. Состав фонда достигает 15-20 и более
соединений.
Нуклеотидный фонд выбранной стадии развития культуры дает определенную
информацию о биохимических процессах, происходящих в клетке. Нуклеотиды -
не только исходный материал для синтеза нуклеиновых кислот, они входят в
состав многих важнейших коферментов и сами являются коферментами в
синтезе и превращениях белков, углеводов, липидов [19].
В первые часы роста культуры синтезируются адениловые производные. АТФ
участвует в процессах фосфорилирования всех прочих нуклеотидов, в
реакциях, связанных с превращением энергии, переносом фосфатных групп. В
лог-фазе развития грибов происходит интенсивный синтез полисахаридов,
компонентов клеточной стенки. Коферментами в процессах синтеза хитина,
фунгина и других полисахаридов являются уридиловые производные - УТФ,
УДФ-глюко-за, УДФ-Ы-ацетилглюкозамин. Цитидиловые нуклеотиды участвуют в
липидном обмене.
В нуклеотидном фонде грибов обнаружены нетипичные нуклеотидсодержащие
соединения, возможно, промежуточные метаболиты реакций синтеза - распада
более сложных компонентов: в кислоторастворимой фракции мицелия Fusarium
и Claviceps - гуанозинпро-пионовая кислота, в нуклеотидсодержащих
соединениях адениловой и уридилозой природы у Penicillium chrysogenum -
салициловая кислота.
Нуклеотидный фонд необходимо изучать: 1) в динамике развития культуры; 2)
в выбранной фазе роста. Исследования динамики содержания нуклеотидов в
клетке проводят без учета их функциональной активности, поскольку
частичный или полный гидролиз нуклеотидсодержащих соединений приводит к
анализу четырех компонентов, что упрощает и обедняет информацию.
В результате гидролиза общего нуклеотидного фонда 70%-ным раствором
хлорной кислоты при 100° С в течение часа образуются аденин,
250
гуанин, цитозин, урацил. Эти основания легко анализируются методами
бумажной йли тонкослойной хроматографии. Более мягкий гидролиз (1 н.
раствор соляной кислоты, 1 ч при 100° С) разрушает пуриновые производные
до оснований, пиримидиновые - до мононуклеотидов. Два основания и два
нуклеозидмонофосфата также разделяются методами хроматографии [224].
Смесь нуклеотидов постепенно гидролизуется до монофосфатов при
хроматографии в очень кислых системах. В системах метанол -
концентрированная соляная кислота - вода (7:2: 1) и метанол - этанол -
концентрированная соляная кислота - вода (50 : 25 : 6 : 19) весь
нуклеотидный фонд распределяется на бумажной хроматограмме в следующей
последовательности от старта: ГМФ, АМФ, ЦМФ, УМФ.
Полный анализ нуклеотидного фонда включает хроматографию на колонке с
анионообменной смолой с последующим разделением гетерогенных фракций с
помощью бумажной хроматографии и идентификацией гомогенных соединений
физико-химическими методами. Для работы необходимы спектрофотометр,
автоматический коллектор фракций, хроматографические камеры,
хроматографическая бумага.
Нуклеотидкоферменты легко гидролизуются в кислых растворах. Например,
скорость распада АТФ до АДФ в слабом растворе кислоты составляет около
0,35% в час. Поэтому выделение и фракционирование фонда рекомендуется
вести на холоду. Замораживание мицелия до - 20° С и долгое хранение в
таких условиях также приводят к качественному и количественному изменению
фонда [20].
VII.2. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ [224]
Разделение нуклеотидов с помощью ионообменной хроматографии обычно
осуществляют на колонках, заполненных сильноосновной анионообменной
смолой "Дауэкс 1". Ионообменные смолы получают путем сополимеризации
стирола - линейного полимера и дивинилбензола. Дивинилбензол образует
поперечные связи (сшивки) между цепями
полистирола. Обозначения "Х8", "X10" указывают на процентное содержание
дивинилбензола в смоле. В буферном растворе смола набухает и ее частицы
образуют решетчатую структуру, которая обеспечивает проникновение
нуклеотидов внутрь матрицы к заряженным группам на ионообменном участке.
Ионный обмен происходит практически мгновенно, и является равновесным
процессом.
R ОН
\ . |
N+ . . . . СОО- + 0 - Р - О - N #
\ I
(СН3)3 ОН
R ОН
\ I
. . . . ~0 -Р-О-N + СОО~
\ I
(СНз)3 ОН
Чем выше заряд обменивающейся молекулы, тем прочнее она связывается со
смолой и тем труднее обменивается на другие ионы.
251
VII.2.1. ПОДГОТОВКА И РЕГЕНЕРАЦИЯ СМОЛЫ
Сухую смолу Дауэкс (I X (8 - 10), 100-200 (200- 400)меш) заливают
дистиллированной водой, плохо оседающую "пыль" сливают, заливают новую
порцию воды и перемешивают. Эту операцию повторяют несколько раз, после
чего оставляют смолу для набухания на ночь. В набухший сорбент наливают
смесь из равных объемов 2 н. раствора формиата натрия и 2 н. раствора
муравьиной кислоты и оставляют на 3-4 ч при периодическом перемешивании.
Затем смолу отмывают дистиллированной водой и вносят в колонку диаметром
0,9- 1,0 см. Высота слоя смолы в колонке должна составлять 20 см. Через
колонку пропускают 2-3 объема (от объема смолы) 75%-ного раствора
