Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Полученный профиль элюции дает первую информацию о компонентах
нуклеотидного фонда. Как видно из рис. 101, смесь нуклеотидов
фракционируется в определенной последовательности: монофосфаты цитидина,
аденозина, гуанозина, уридина, далее ди- и трифос-фаты в том же порядке.
Нуклеотидный фонд всегда содержит большое количество производных моно-,
ди- и трифосфатов, и в одном пике часто находится несколько соединений.
Дальнейшее фракционирование и идентификация этих производных -
кропотливая, но интересная задача.
VII.3.1. ХРОМАТОГРАФИЯ [224]
Метод основан на распределении соединения между двумя жидкими фазами.
Хроматографическая бумага поглощает воду из атмосферы и задерживает ее
целлюлозными волокнами, Эту воду можно рассмат-
254
ривать как один из растворителей - неподвижная фаза. Неводный
растворитель (подвижная фаза) движется по бумаге под действием
капиллярных сил и распределяет молекулы нанесенного на бумагу вещества
между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем
выше растворимость вещества в подвижной фазе,
Таблица 16. Аналитические характеристики некоторых УФ-поглощающих
соединений, выделенных из мицелия Penicillium sizovae и Aspergillus
pallidus
Соединение ^шал о со см \ о ю см Ы о со см о 00 см Rf АМФ
$ pH 12,0 1 2 3
Аденозин 1,3 2,9 1,46
ЦМФ 278 272 0,53 1,9 - - 0,85
НАД 260 0,85 0,26 0,47 0,90 0,86
АМФ 259 258 0,86 0,22 1,0 1,0 1,0
Сукциниладено- 267 269 0,80 0,43 1,3 - -
зин
ГМФ 256 258 1,00 0,65 0,78 0,80 0,60
УМФ 260 260 0,74 0,42 1,1 1,2 0,63
АДФ 259 257 0,82 0,23 0,78 0,68 0,74
Г ДФ-манноза - - 1,12 0,60 - 1,1 -
УДФ-глюкоза 262 262 0,75 0,34 0,89 1,58 0,87
ЦДФ-Ы-ацетил- 262 262 0,76 0,33 0,81 1,83 0,40
глюкозамин
ГДФ 256 258 0,97 0,70 0,60 0,36 0,35
УДФ 0,88 0,39 - 0,86 -
АТФ 259 258 0,85 0,30 0,60 0,30 0,47
ГТФ - - - - - - 0,20
УТФ 0,24
тем дальше оно продвигается по бумаге. Коэффициент распределения (Rf) для
данного вещества определяется следующим отношением:
Rf = расстояние, пройденное растворенным соединением/расстояние,
пройденное фронтом растворителя.
В литературе часто приводят коэффициенты распределения нуклеотидов по
отношению к одному из свидетелей - АМФ или УМФ, т. е. Rf АМФ и УМФ.
Коэффициент распределения свидетеля принимают за 1,0.
Хроматографию нуклеотидов можно выполнять практически на всех типах
хроматографической бумаги, но наиболее воспроизводимые результаты
получаются на бумаге FN-11, FN-13 (ГДР) и Ватман.
Сухие остатки, полученные после хроматографии на колонке, растворяют в
небольшом количестве (точный объем) воды и наносят на листы
хроматографической бумаги в количестве 0,05-0,2 мл. Каждую пробу
подвергают хроматографическому разделению в трех системах растворителей:
1) этиловый спирт - 1М аммонийацетатный буфер, pH 3,8 (75 : 30); 2)
этиловый спирт - 1 М аммонийацетатный буфер, pH
7,5 (75 : 30); 3) изомасляная кислота - 1,0 н. раствор аммиака (10 :
6).
255
Применение трех систем для каждой пробы - обязательное условие
определения гомогенности индивидуальных соединений. Параллельно с пробами
наносят нуклеотиды - свидетели, ожидаемые в этом пике. Продолжительность
нисходящей хроматографии составляет 12-16 ч. Разделение смеси
нуклеотидов, входящих в пик, было достаточным при одноразовом прохождении
растворителя.
Хроматограммы сушат на воздухе под тягой, и зоны веществ, поглощающих УФ,
обнаруживают с помощью ультрахемископа Брум-берга. Зоны обрисовывают
карандашом, определяют значения Rf (Rf АМФ) и сравнивают со свидетелями.
Значения Rf АМФ некоторых нуклеотидов и их производных, наиболее часто
наблюдаемых в фонде грибов, приведены в табл. 16. Значения Rf получены в
условиях лаборатории и не являются абсолютными. На коэффициенты
распределения могут оказывать влияние такие факторы, как температура,
герметичность и насыщенность парами растворителя хроматографической
камеры, содержание солей в пробе и др.
VII.3.2. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ [91]
УФ-поглощающие зоны хроматограммы вырезают, измельчают и экстрагируют
вещества 0,1 н. раствором соляной кислоты (5 мл) в течение ночи при
комнатной температуре. В каждой пробе определяют длину волны при
максимальном поглощении и поглощение (экстинк-цию) при 250, 260, 270,
280, 290 нм. По отношениям поглощений 250/ 260, 270/260, 280/260 и
290/260 в кислой и щелочной (pH 12) средах аде-ниловые, гуаниловые,
цитидиловые и уридиловые производные легко идентифицируются с помощью
таблиц Венкстерна и Баева (см. табл. 16). В некоторых случаях необходимо
бромирование оснований для установления принадлежности данного соединения
к адениловым или уридиловым производным. Бромирование выполняется прямо в
спектрофотометрических кюветах, методика описана в работе [91].
Бромирование уридиловых нуклеотидов приводит к исчезновению максимума при
X = 260 нм, адениловые производные не бромируются.
VII.3.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДОВ
Концентрат но нуклеотидов в анализируемых пробах рассчитывают по формуле
