Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
высушивают в сушильном шкафу при 120° С в течение 30 мин. При силе тока
около 1 мА и напряжении 120-150 В белок перемещается на 5-7 см примерно
за 2,5 ч.
Электрофореграммы окрашивают бромфеноловым синим, помещая их на 10-20 мин
в ванну с красителем, затем раствор сливают и электрофореграммы
многократно промывают. После окрашивания электро-фореграмм видны пятна,
соответствующие локализации фракций белков. Для определения соотношения
между отдельными фракциями белка электрофореграмму разрезают. Фракции
белков экстрагируют, помещая кусочки бумаги в пробирки и добавляя по 5 мл
0,01 н. раствора NaOH. Через 30 мин раствор фотометр и р уют. Контролем
служит элюат чистой полоски бумаги в 5 мл 0,01 н. NaOH.
Лучшие результаты получают при обработке проб другим способом. Если
испытуемые вещества не поглощают свет в видимой и ультрафиолетовой частях
спектра, то по окончании электрофореза необходимо окрасить препарат.
Белки окрашивают водным раствором, содержащим 500 мг бромфенолового
синего, 50 г сулемы в 1 л. Бумажные полоски высушивают, погружают в
раствор краски на 6 ч при комнатной температуре, избыток краски отмывают
дважды 5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 5 мин.
Электрофореграмму фиксируют раствором, содержащим 50 мл уксусной кислоты
и 4 г ацетата натрия в 1 л и высушивают в течение 15 мин.
Электрофореграммы с синей окраской анализируют фотометрически. Перед
анализом их помещают в камеру с парами аммиака и приступают к
фотометрированию спустя 10 мин после обработки. Такой же оттенок
приобретают электрофореграммы при погружении в 10%-ный эфирный раствор
диэтиламина с последующим высушиванием, причем получившаяся окраска
стабильна. Для окрашивания применяют также насыщенный раствор
амидочерного в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении
9:1. Время окрашивания - 10 мин при постоянном встряхивании.
VI.2 4. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Стеклянные пластинки размером 25 X 180 мм промывают хромовой (серная
кислота и бихромат калия) и с.пирто-эфирной смесями (1 : 1).
Агаровый гель готовят из 2-4%-ного раствора агара в дистиллированной
воде. На стеклянную пластинку михропипеткой наносят
242
несколько капель по 5 мл растворенного агара, оставляют на 1 ч для
образования геля. Затем стеклянные пластинки переносят в камеры. Агаровый
гель соединяют с буферным раствором двухслойными полосками
хроматографической бумаги. Раствор белка наносят на полоски
фильтровальной бумаги размером 2 X 20 мм. Затем пинцетом переносят их на
агаровый гель, размещая по центру, и проводят электрофорез. Белковый
раствор переходит из бумаги в гель. Напряжение тока 150-160 В, сила тока
1,3-1,6 мА, время электрофореза 6 ч. После окончания электрофореза
пластинку с агаром фиксируют в течение 3 ч, высушивают в термостате при
37° С, окрашивают красителем в течение 18 ч. Окрашенные пластинки
промывают трижды 2%-ным раствором уксусной кислоты по 5-10 мин и в
течение 2 мин 10%-ным раствором уксусной кислоты с 2%-ным раствором
ацетата натрия. Окрашенные и промытые пластинки помещают в термостат при
температуре 37-40° С до полного высушивания. Электрофореграммы
расшифровывают денситометрически.
VI.2.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КРАХМАЛЬНОМ ГЕЛЕ
Гель готовят нагреванием 100 мл суспензии крахмала (15%-ный раствор) с
буферным раствором в круглодонной колбе емкостью 500 мл над пламенем (не
допуская кипения) при постоянном вращении до момента образования
гомогенного раствора. Этот раствор наливают в пластмассовую кювету и
накрывают полиэтиленовой пластинкой с поверхностью, покрытой тонким слоем
минерального масла, и оставляют до застывания. Гель помещают в кювету
между электродами и делают поперечный разрез лезвием бритвы. В разрез
вставляют кусочек фильтровальной бумаги, смоченной испытуемым раствором
белка. Электрофорез проводят в течение 6 ч при комнатной температуре;
градиент напряжения 6 В/см, что соответствует силе тока 4-5 мА на каждый
гель. После окончания электрофореза гель осторожно извлекают из кюветы,
помещают на стеклянную пластинку и разрезают лезвием бритвы пополам вдоль
горизонтальной поверхности, так как внутри геля зоны локализации белков
выявляются наиболее четко. Оба слоя геля быстро разделяют, погружают в
насыщенный раствор амидо-черного в смеси метанола, уксусной кислоты и
воды в соотношении 50 : 10 : 50 на 0,5 ч и промывают в трех сменах
растворителя. В последней промывной жидкости гель оставляют на 2 ч.
Окрашенные гели могут сохраняться 6 мес под слоем растворителя.
Белок микроскопических грибов по своим свойствам близок к растительным
белкам, поэтому удобно пользоваться методом электрофореза белков в
полиакриламидном геле, описанным Сафоновым и др. [403, 404].
YI.2.6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
В настоящее время широко используют метод электрофореза белков в
полиакриламидном геле [121, 129, 247, 379, 403. 4Q4, 418, 560, 835]. Этот
метод применяют для разделения белков в пелях выяснения морфогенеза
