Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
проводить препаративное разделение смеси, потому что в чистом виде можно
выделить только самый быстрый и самый медленный компоненты.
Микроскопическим электрофорезом разделяют суспензии, наблюдают
перемещение частиц между электродами и измеряют скорость их движения.
Этот метод не применяют широко для электрофореза белков, так как
ультрамикроскопию и микроскопию невозможно использовать для наблюдения за
белковыми частицами.
С помощью иммуноэлектрофореза определяют число компонентов смеси и
идентифицируют эти компоненты по их электрофоретической подвижности,
пммупохимической специфичности, химической природе или другим свойствам.
Этим методом можно выявить только те компоненты, которые способны давать
реакцию преципитации с антителами. Благодаря специфичности реакпнп
преципитации можно различить вещества с одинаково:! электрофоретической
подвижностью. Высокая чувствительноегь этого метода позволяет определять
вещества в очень малых концентрациях,
240
В качестве носителей в электрофорезе используют ватмановскую бумагу,
агаровый и крахмальный гели, полиакриламид. Электрофорез на бумаге
применяют для исследования низкомолекулярных веществ и пептидов.
Аппаратура и все операции очень просты. Анализ проводят на поверхности
бумаги по специфической окраске зон, их ферментативной активности,
радиоактивности. Недостаток метода - значительная адсорбция и денатурация
белка. Смещение зон в носителе зависит от скорости движения буферного
раствора, силы тяготения, уровня буферного раствора в электродном сосуде,
испарения раствора с поверхности носителя. Значительный недостаток метода
- невозможность прямого фотометрического анализа для количественного
определения фракций.
Более удобен электрофорез в гелях. Можно изготовлять гели с разным
размером пор в зависимости от целей исследования. В этих условиях
подвижность белковых молекул зависит от их размеров. Адсорбция во многих
гелях незначительна. Гели отличаются от жидких сред большей вязкостью и
более высоким сопротивлением, что позволяет разделять сложные белковые
смеси. Электрофорез в гелях используют обычно с аналитической целью, а
для количественного определения компонентов смеси применяют метод прямого
фотометр и рования после предварительной окраски на поверхности геля.
Гели готовят из агар-агара, крахмала и полиакриламида. Агар-агаровый гель
удобен благодаря возможности приготовления из него пластин различной
формы и толщины, пластичности при подогреве и плотной консистенции при
комнатной температуре. Недостатком агар-агарового геля являются входящие
в его состав полисахариды, образующие комплексы со щелочными белками и
некоторыми липопротеидами.
Крахмальный гель в отличие от агарового обладает свойствами
"молекулярного сита" что позволяет разделять смеси биополимеров не только
по величине электрического заряда, но и по размерам молекул. Крахмальный
гель используют для идентификации гемоглобинов,
изоферментов,наследственно детерминированных белков. Недостаток метода -
непрозрачность геля, что усложняет идентификацию и количественное
определение отдельных фракций.
Наиболее чувствительный метод - электрофорез в полиакриламидном геле -
синтетическом полимере из веществ определенной химической структуры и
высокой степени чистоты. Размеры пор полиакриламидного геля можно широко
варьировать, изменяя его концентрацию от 2 до 30%. Гель прозрачен.
VI.2.2.1. ПОДГОТОВКА МИЦЕЛИЯ
Для разрушения мицелия грибов используют шок-трубку [573]. Мицелий
отфильтровывают и трижды промывают холодной дистиллированной водой. 1 г
сырого мицелия помещают в 9 мл охлажденного 0,67 М фосфатного буфера (pH
7,0) и интенсивно встряхивают со стеклянными бусинками при 35° С 30 мин.
Суспензию центрифугируют при 25 тыс. об/мин в течение 30 мин. Пробы белка
(0,04 мг) подвергают электрофорезу. Общее содержание белка определяют
методом Лоури [121, 222, 678] или Беннета [512].
VI.2.2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ
Мединал-вероналовый буфер; pH 8,6 (10,32 г мединала и 1,84 г веронала на
1 л воды); Трис-буфер, pH 8,9 (10,082 г трис-гидроокси-метиламинометана,
1,307 г динатрийэтилендиаминотетраацетата, 0,787 г
241
борной кислоты в 1 л воды); щелочной глициновый буферный раствор с ионной
силой 0,07 и pH 8,8. Для электрофореза в крахмальном геле используют
буферный раствор, содержащий 0,03 М НаБОч и 0,012 М NaOH.
VI.2.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА БУМАГЕ
Бумагу смачивают буферным раствором и помещают на другой лист
фильтровальной бумаги для удаления избытка жидкости. Затем переносят ее в
аппарат на обработанную силиконом полированную стеклянную пластинку, не
погружая концы бумажной полосы в буферный раствор. Белок наносят круглым
пятном с помощью капиллярной пипетки. На бумагу накладывают вторую
стеклянную пластинку, концы бумаги погружают в электродные сосуды, бумагу
фиксируют. Систему оставляют на несколько минут для установления
равновесия, затем включают ток. По окончании опыта полосы бумаги
