Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 122

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 279 >> Следующая

муравьиной кислоты и окончательно отмывают до значений pH, характерных
для воды. Колонка со смолой в формиатной форме готова к анализу.
Регенерацию смолы после опыта выполняют следующим образом: верхний темный
слой удаляют, вносят недостающее количество сорбента, пропускают 2-3
объема муравьиной кислоты и промывают водой. Следят, чтобы над смолой
всегда был слой воды.
VII.2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДОВ ИЗ МИЦЕЛИЯ
Навеску сырого мицелия промывают холодной водой и кислоторастворимые
соединения экстрагируют холодным 0,5 н. раствором хлорной кислоты в два
приема по 200 мл в течение 60 и 30 мин. В отфильтрованный экстракт вносят
активированный уголь из расчета 1,0 г на 10 г сырого мицелия. Хорошие
результаты по сорбции нуклеотидов получают с импортными марками углей
"Карборафин", "Норит", "Мерк" и отечественной маркой "А". Предварительно
уголь кипятят с 1 н. раствором соляной кислоты в течение часа, затем
отмывают водой, 1 н. раствором аммиака, метанолом и вновь водой.
Сорбцию на уголь ведут на холоду при периодическом перемешивании,
проверяя остаточную оптическую плотность при 260 нм, до тех пор, пока
количество УФ-поглощающего материала в фильтрате не превысит 10%
исходного. Уголь тщательно отмывают водой на воронке Бюхнера и тут же
элюируют УФ-поглощающие соединения 50%-ным водным раствором этилового
спирта с 1,0% аммиака. Элюцию выполняют небольшими порциями на той же
воронке Бюхнера. Элюаты объединяют и проверяют полноту десорбции с
помощью спектрофотометра. Объединенные спиртовые фракции упаривают на
роторном испарителе под вакуумом при 35-40° С до небольшого объема.
Водный концентрат подщелачивают до pH 8,2 раствором гидроокиси бария и
добавляют этиловый спирт до 75%-ной концентрации. Раствор ставят в
холодильник. Хлопьевидный осадок бариевой соли нуклеотидов отделяют
центрифугированием; надосадочная жидкость содержит нуклеозиды и
основания. К осадку добавляют любой катионит в Н"^-форме (Дауэкс 50, КУ-
2) в набухшем состоянии. Смесь перемешивают 5-10 мин стеклянной палочкой
до исчезновения беловатой мути. Смолу отделяют центрифугированием,
раствор нуклеотидов подщелачивают до pH 7-8. Концентрат можно хранить в
замороженном состоянии в морозильной камере или анализировать сразу.
252
VII.2.3. КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ КИСЛОТОРАСТВОРИМЫХ НУКЛЕОТИДОВ
При хроматографии смеси нуклеотидов используют градиентную элюцию.
Система для колоночной хроматографии состоит из двух стаканов на 600 мл
(резервуар) и 300 мл (смеситель), соединенных резиновыми или силиконовыми
шлангами (рис. 100). Смеситель соединен шлангом с колонкой и снабжен
магнитной мешалкой непрерывного действия.
Смесь нуклеотидов в водном растворе (pH 7-8) осторожно наносят на верхний
слой смолы, и по мере сорбции стенки колонки про-
Рис. 100. Схема элюирующей системы для колоночной хроматографии
нуклеотидов:
1 - резервуар; 2, 6 - кран (винтовой зажим); <3 - смеситель; 4 -
магнитная мешалка; 5 - колонка со смолой; 7 - автоматический коллектор
фракций.
мывают водой. Колонку промывают 2-3 объемами воды, закрывают кран выхода
из колонки, наливают воду почти доверху колонки и соединяют ее с
элюирующей системой. В смеситель наливают 250 мл дистиллированной воды,
включают магнитную мешалку, и в резервуар заливают первую элюирующую
систему. Резервуар поднимают до совмещения уровня жидкости в нем с
уровнем в смесителе и открывают кран между этими сосудами. Постепенно
открывают кран (винтовой зажим) при выходе из колонки и устанавливают
скорость истечения раствора 0,8-1,0 мл/мин. Фракции объемом 5 мл собирают
с помощью автоматического коллектора фракций.
Элюирующие системы:
1) 200 мл 0,6 н. раствора муравьиной кислоты;
2) 300 мл 1,0 н. раствора муравьиной кислоты;
3) 500 мл 3,0 н. раствора муравьиной кислоты;
4) 400 мл 4,0 н. раствора муравьиной кислоты, содержащей
0,2 М
фирмиата аммония;
5) 600 мл 4,0 н. раствора муравьиной кислоты, содержащей 0,4 М формиата
аммония;
6) 500 мл 4,0 н. раствора муравьиной кислоты, содержащей 0,8 М формиата
аммония.
В каждой фракции определяют оптическую плотность при 260 нм против воды,
значения экстинкции откладывают по оси ординат на миллиметровой бумаге,
номера фракций - по абсциссе. Полученные
253
точки соединяют. Пример профиля элюции смеси нуклеотидов показан на рис.
101.
Фракции, составляющие отдельный пик, объединяют и упаривают на роторном
испарителе при 30-40° С, если пик элюировался му-
Экстинкция
Рис. 101. Профиль элюции нуклеотидов с хроматографической колонки:
1 - ЦМФ; 2 - НАД; 3 - АМФ; 4 - сукциниладенозин; 5 -
ГМФ; 6 - УМФ; 7, 8 - АДФ + ГДФ-манноза; 9 - УДФ-
N-ацетилглюкозамин; 10 - УДФ-глюкоза; // - ГДФ; 12 -
УДФ; 13 - АТФ; 14, 15 - ГТФ + УТФ.
равьиной кислотой. Фракции с формиатом аммония объединяют. УФ-поглощающие
соединения сорбируют на уголь с последующей десорбцией щелочным раствором
спирта. Спирт упаривают досуха и пробы хранят в морозильной камере
холодильника.
VII.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed