Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
грибов [835], их таксономии [606, 700, 831], а также для изучения белков
различных органелл клетки [99, 405]. Методом электрофореза исследованы
белки аспергиллов [513], фузариев [700],
243
вертидиллов [5], нейроспор [539], пенициллов [513] и других
микроорганизмов [122, 475]. Авторы перечисленных работ пользовались
разными методиками, что весьма затрудняет анализ этих данных в
сравнительном аспекте.
Разделение белков в полиакриламидном геле с помощью метода и реактивов
фирмы "Реанал" [418]. При применении этого метода можно использовать
любые буферные системы и разные концентрации геля.
Рис. 96. Основные детали прибора для электрофореза в полиакриламидном
геле:
а - зажимное кольцо с резьбой; б - конусное кольцо; в- резиновое кольцо-
прокладка; г - стеклянная трубочка для полимеризации геля и последующего
электрофореза; д - подставка из оргстекла; е - угольные электроды; ж -
плексигласовые держатели электродов.
Метод позволяет анализировать гомогенность белков, определять
молекулярную массу, структуру, изучать процессы превращения, разделения и
фракционирования белков клетки и ее структур. .
Заранее приготовленные и хранящиеся в холодильнике реактивы (см.
приложение 5) перед работой выдерживают некоторое время для нагревания до
комнатной температуры. Для полимеризации геля и электрофореза используют
стеклянные трубочки (рис. 96, г) с отшлифованными концами, с внутренним
диаметром 6 и длиной 100 мм. На дно трубочек надевают резиновое кольцо-
прокладку (рис. 96, в), на противоположный конец - конусное кольцо (рис.
96, б) и зажимное коль-
244
Рис. 97. Подготовленная к работе стеклянная трубочка.
цо с резьбой (рис. 96, а). Собранные колонки укрепляют в углублениях
подставки из органического стекла (рис. 96, д). Резиновое кольцо-
прокладка плотно зажимается между поверхностями подставки и конусного
кольца, предотвращая утечку жидкости.
Готовят раствор мелкопористого геля задаваемой пористости и pH буферной
системы. Основные растворы хорошо смешивают в кол-
бе Бунзена (1 объем смеси 1щ и 1 объем раствора 2Щ, а также 1 объем смеси
1ки 1 объем раствора 2К; см. приложение-5). Растворенный воздух удаляют
вакуумом, чтобы избежать образования воздушных пузырьков в процессе
полимеризации, что в значительной мере препятствует электрофорезу.
В стеклянные трубочки (рис. 96, г) вносят пипеткой по 2 мл раствора
мелкопористого геля, на поверхность этого раствора наслаивают 0,2-0,3 мл
деминерализованной воды или раствора А, разбавленного в 7-8 раз
(наслаивание раствора или воды - одна из критических операций при
приготовлении геля, от которой зависит качество электрофореграммы). Через
30- 40 мин полимеризация акрил-амида завершается. Об этом судят по
слабому нагреванию стеклянных трубочек и по образованию хорошо видимой
границы
Рис. 98. Подставка с ввинченными стеклянными трубочками для полимеризации
геля.
245
раздела между гелем и наслоенным раствором. Быстрым движением руки
осторожно стряхивают с геля наслоенный раствор. После образования геля
исчезает необходимость в резиновых кольцах-прокладках и в конусных
кольцах. В дальнейшем стеклянные трубочки в подставке крепят только
зажимными кольцами, которые на 1-1,5 мм больше
внешнего диаметра стеклянной трубочки (рис. 97, 98).
Готовят раствор крупнопористого геля. Отсос воздуха необязателен, однако
следует предохранять раствор от воздействия' света из-за присутствия
чувствительного к нему рибофлавина. Стеклянные трубочки ополаскивают 0,1-
0,2 мл раствора мономера для полного удаления остатков наслоенного
раствора. После ополаскивания в каждую колонку пипеткой вносят по 0,2 мл
крупнопористого геля, затем наслаивают 0,1-0,2 мл деминерализованной
воды. Наслаивание в данном случае играет такую же роль, как и в случае
мелкопористого геля. Крупнопористый диск, непосредственно соприкасающийся
с мелкопористым гелем, играет роль промежуточного (spacer) геля. Он
полимеризуется под действием светочувствительного катализатора -
рибофлавина, поэтому собранную установку помещают под ультрафиолетовой
лампой мощностью 250-500 Вт. Фотополимеризация происходит и при обычном
свете, но только за более длительное время. Начало образования геля
фиксируют по переходу флюоресцирующего желто-зеленого цвета в опаловый, а
конец - по резкому отделению геля от наслоенной жидкости. По окончании
полимеризации наслоенную жидкость сливают с геля и ополаскивают гелевые
трубочки раствором крупнопористого геля, заранее приготовленного для
анализа. Раствор белка смешивают с раствором крупнопористого мономера в
соотношении 1 : 2. Такой состав гарантирует отличную полимеризацию геля-
образца (sample). При приготовлении раствора геля-образца надо учитывать,
что в одной колонке можно разделить 200-250 мкг белка. Более
концентрированные растворы белка необходимо разбавлять перед смешиванием
(например, раствором крупнопористого геля). Если тестируемый раствор
содержит вещества, подавляющие полимеризацию, то его следует разбавлять в
