Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Л = Е% V/E • 10~3, где А- концентрация нуклеотида
т лтах
(мкмоль); Е^ -экстинкция при максимальном поглощении; V-
объем пробы (мл); ?• 10~3 - молярный коэффициент экстинкции. Ниже
приведены молярные коэффициенты экстинкции при pH 2,0:
Нуклеотиды
Адениловые Г уаниловые Уридиловые Цитидиловые
Концентрация нуклеотидов после хроматографии в кислых системах (см. выше)
определяется по следующим формулам (мкмоль/5мл):
256-
'max' нм Е . 10~'
257 15,1
256 12,2
262 10,0
280 13,0
адениловых - А = 0,363 • А260 (А260 = ?2бо - Е290); гуаниловых - А = 0,47
• А255 (А255 = ?2бб - ?2эо); цитидиловых - А = 0,73 X X А270 (А270 = ?270
- ?2эо); уридиловых - А = 0,515 • А260 (А260 =
- ?гво ^29о)*
V1I.3.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ФОСФАТНОЙ
ГРУППЫ
Нуклеозидмонофосфаты, выделенные из грибов, наряду с фосфатной группой в
5'-положении содержат также нуклеозид-3'(2')-фос-фаты. Местоположение
фосфатной группы по отношению к рибозе определяют бумажной
хроматографией, реакцией с орцином или с карбазолом.
VII.3.4.1. ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
В системе изопропиловый спирт- 1%-ный водный раствор сернокислого аммония
(2 : 1) удается разделить пуриновые мононуклеотиды в зависимости от
локализации фосфорного остатка:
Нуклеотид Rf Нуклеотид Rf
5'-ЦМФ 0,70 2'-ГМФ 0,49
5'-АМФ 0,30 З'-ГМФ 0,39
2'-АМФ 0,27 5'-УМФ 0,70
З'-АМФ 0,17
VII.3.4.2. РЕАКЦИЯ С ОРЦИНОМ
Принцип реакции состоит в том, что пуриновые нуклеотиды реагируют с
орцином с образованием окрашенного комплекса, но 5'-фосфаты вступают в
реакцию значительно быстрее, чем 2'(3')-фосфаты.
К пробе объемом 3 мл, содержащей 10-30 мкг АМФ или ГМФ, добавляют 3 мл
0,1%-ного раствора хлорного железа в концентриро-
Таблица 17. Зависимость времени реакции пуриновых нуклеотидов с орцином
от положения фосфатной группы, определяемая по окрашиванию образующегося
комплекса, %
Время реакции, мин
Соединение 7 15 25 35 45
З'-АМФ 26,5 62,0 86,5 97,0 100
5'-АМФ 66,0 92,0 99,2 100 <100
З'-ГМФ3 26,9 60,8 87,0 97,4 100
ванной соляной кислоте и 0,3 мл спиртового раствора орцина (10 мг/мл в
95%-ном спирте). Смесь встряхивают и сразу колориметрируют при 660 нм,
затем пробу нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин, охлаждают
и вновь измеряют экстинкцию. Операцию повторяют через 15, 25, 35 и 45
мин. Зависимость продолжительности реакции от положения фосфатной группы
представлена в табл. 17.
9 2-66
257
VII.3.4.3. РЕАКЦИЯ С КАРБАЗОЛОМ
В ходе реакции 5'- и З'-фосфаты образуют различно окрашенные продукты. К
1 мл пробы (0,1-1,0 мкмоль) добавляют при перемешивании 5 мл 75%-ного
раствора серной кислоты и 1 мл свежеприготовленного раствора карбазола в
абсолютном этилоеом спирте (0,5 г в
Таблица 18. Максимильная экстинция окрашенных карбазолом производных 3'-
и 5'-фосфатов
Положение фосфатной группы Концентрация, МКМОЛЬ ?71 ( ?",о ^54о/^710
5'-фосфат З'-фосфат 0,5 0,345 0,176 0,510
0,5 0,049 0,415 8,4
100 мл). Смесь помещают на бурнокипящую баню на 2 мин, после чего
охлаждают водой. В результате реакции 5'-фосфаты дают зеленовато-голубую
окраску (к = 710 нм), З'-фосфаты - пурпурную (с максимумом при 540 нм)
(табл. 18).
VII.3.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НУКЛЕОТИДСАХАРОВ
Нуклеотиды, содержащие в своей молекуле углеводный фрагмент, подвергают
мягкому кислотному гидролизу 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение
10 мин на кипящей водяной бане. Пробу до и после гидролиза
хроматографируют в системе растворителей 2 (см. VI 1.3.1)
для определения полноты гидролиза и определяют качественное и
количественное содержание нуклеотидного компонента в виде дифосфата.
Углеводный фрагмент подвергают хроматографическому разделению в системе
бутанол - уксусная кислота - вода (66 : 10 : 27) с возможными
свидетелями. Хроматограмму проявляют 0,5%-ным раствором 2,3,5-
трифенилтетразолий-хлори-да (0,5%-ный раствор реактива смешивают с 10%-
ным раствором едкого натра в 60%-ном метаноле в соотношении 1 : 3).
Сахара проявляют в виде ярких вишнево-красных пятен на белом фоне. Можно
рекомендовать и другие реагенты: аммиачный раствор азотнокислого серебра,
антрон, 2,4-динитрофенилгидразин с повторным опрыскиванием раствором
феррицианида натрия и т. д. (табл. 19). Количественное определение N-
ацетиламиносахаров выполняют после мягкого гидролиза УДФ-производных, как
описано выше. Для проведения реакции необходимы тетраборат калия и я-
диметиламинобензальдегид.
Таблица 19. Коэффициенты распределения обычно встречающихся сахарных
компонентов нуклеотидов
Сахара Rf (глю- коза)
Глюкоза 1,0
Г алактоза 0,97
Манноза 1,18
Рибоза 2,12
N-Ацетил глюкоза 1,43
Глюкозамин 0,65
258
Приготовление реактивов. А. Тетраборат калия готовят смешиванием
рассчитанных количеств борной кислоты и гидроокиси калия. Раствор
концентрируют, кристаллы собирают, промывают холодной водой и сушат.
Используют 0,8 М раствор, подщелоченный до pH 9,1 раствором едкого кали.
Б. 10,0 г я-диметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл ледяной
уксусной кислоты, содержащей 12,5% (по объему) 10 н. раствора соляной
