Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 112

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 279 >> Следующая

соответствующим образом подготовлен. Подготовка сводится главным образом
к удалению из биологических проб примеси солей и белков, а из белкового
гидролизата - кислот.
VI.1.3.1. ЭКСТРАКЦИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ ИЗ МИЦЕЛИЯ
Для экстрагирования свободных аминокислот из грибного материала
необходимо отфильтровать мицелий от культуральной жидкости. Культуральную
жидкость центрифугируют при 3000 об/мин. Мицелий тщательно промывают,
излишек воды отсасывают на Бюхнеровской воронке. Часть мицелия
используют для определения влажности, другую - для извлечения
свободных аминокислот. Извлекают амино-
кислоты из мицелия 80%-ным водным этанолом либо 20%-ным раствором ТХУ или
горячей водой (табл. 15). Однако извлечение аминокислот
ТХУ имеет существенный недостаток - при хроматографии экстрактов на
бумаге возникают
окрашенные в желтый цвет "хроматографические хвосты". В отличие от
спиртовых экстрактов водные не требуют дополнительной обработки для
освобождения от липидов [18, 772].
Навеску мицелия заливают дистиллированной водой и экстрагируют в течение
10 мин на кипящей водяной бане. Мицелий отделяют центрифугированием или
фильтрацией. В фильтрат добавляют тройной объем этанола и несколько
капель ледяной уксусной кислоты. Образовавшийся осадок отделяют
центрифугированием, надосадочную жидкость упаривают на водяной бане
досуха, а сухой остаток смывают 10%-ным водным раствором изопропилового
спирта (температура экстракта при выпаривании не должна превышать 50° С).
Полученные изопропиловые экстракты используют для хроматографии.
Положительной стороной этого метода является отсутствие в экстрактах
пептидов. Для определения наличия пептидов и водорастворимых белков,
оставшихся после осаждения спиртом, экстракты гидролизуют 6 н. НС1. По
разнице содержания а-аминоазота в экстракте до и после гидролиза
определяют наличие или отсутствие белков и пептидов.
При извлечении аминокислот спиртом навеску сухого материала заливают
десятикратным количеством 75-80%-ного водного этанола,
Таблица 15. Методы экстракции свободных внутриклеточных аминокислот
Fusarium moniliforme
Экстрагирующее вещество Количество свободных внутриклеточных
аминокислот (мг аминного азота на 1 г сухой массы мицелия)
80%-ный этанол 3,4
20%-ная ТХУ 3,8
Горячая вода 3,2
292
доводят до кипения и оставляют экстракт в спирте на ночь. Экстракцию
проводят трехкратно. Затем материал промывают этанолом. Экстракты и
смывной этанол объединяют, упаривают до сухого остатка в фарфоровых
чашках на водяной бане с вентилятором или в вакуум-эксикаторе при
комнатной температуре. Кроме аминокислот в спиртовой экстракт переходят
сахара, пигменты, многие минеральные вещества и т. д., поэтому перед
хроматографированием необходимо очищать экстракт. Для очистки экстракт
пропускают через ионооб-менник. Сухой остаток аминокислот растворяют в 1-
2 мл 10%-ного подкисленного соляной кислотой изопропилового спирта. В
замороженном виде экстракты можно хранить в холодильнике в течение
нескольких недель.
VI.1.3.2. СВЯЗАННЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ МИЦЕЛИЯ
Для определения аминокислот, содержащихся в белках мицелия, последние
должны быть предварительно гидролизованы. В мицелии микроскопических
грибов помимо белков содержится значительное количество других веществ, в
частности мононуклеотиды, свободные аминокислоты, липиды и т. д. Перед
гидролизом белка их необходимо удалить из мицелия как балластные
вещества. Для освобождения от свободных аминокислот мицелий тщательно
растирают пестиком в ступке со стеклянным песком, затем на холоде
заливают пятнадцатикратным объемом 5%-ного раствора ТХУ. Взвесь мицелия в
растворе ТХУ вновь центрифугируют для удаления свободных аминокилот,
осадок дважды промывают охлажденной водой.
Мицелий гидролизуют в запаянной ампуле в 6 н. растворе НС1 24 ч при 105-
120° С (2 мл НС1 на 100 мг мицелия). По окончании гидролиза гумины
отфильтровывают. Соляную кислоту удаляют многократным выпариванием под
вакуумом. Гидролизаты обессаливают. Для этого их упаривают в фарфоровых
чашках на водяной бане до консистенции сиропа. Остаток растворяют в 96%-
ном подкисленном этаноле (0,5 мл концентрированной НС1 на 100 мл спирта)
и хранят в течение 12 ч в холодильнике. Аминокислоты переходят в раствор,
а балластные вещества остаются в осадке. Осадок удаляют
центрифугированием, а раствор вновь упаривают, растворяют в подкисленном
спирте и выдерживают в холодильнике в течение 1 -1,5 ч. Такую операцию
повторяют трижды. Для удаления липидов гидролизат взбалтывают несколько
раз в делительной воронке с этиловым эфиром. Затем гидролизат упаривают
на водяной бане до необходимого объема, определяемого по содержанию в нем
аминного азота. Культуральную жидкость упаривают и оставшийся после
экстракции свободных аминокислот осадок гидролизуют.
Метод предварительного фракционирования белковых гидролизатов на
ионообменных смолах на моно- и диаминокислоты не применяют, так как он
больше подходит для препаративного выделения, чем для сравнительного
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed