Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 114

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 279 >> Следующая

переходит в оранжево-красную вследствие образования Cu-производного ДИДА.
Последнее соединение растворимо в 75%-ном этиловом спирте, в связи с чем
при данной операции совмещается образование комплексного соединения с
медью и его экстракция. Пробирки помещают в затемненный бокс на 1 ч и
периодически сильно встряхивают [165, 220].
Опытные пробы фотометрируют против контрольной в ФЭКе с зеленым
светофильтром (ФЭК-56 - 583 нм; ФЭК-М - 540 нм); пересчет показаний ФЭКа
проводят по калибровочной кривой с растворами чистых аминокислот [285,
359]. Для построения калибровочных кривых готовят 0,01 М растворы
аминокислот, содержащие в 1 мкл 0,01 мкМ каждой аминокислоты. Количество
аминокислоты, соответствующее 10 мл 0,01 М раствора, отвешивают на
аналитических весах и растворяют в воде или в 10%-ном изопропиловом
спирте. Раствор тирозина подкисляют 0,1 н. раствором НС1 до полного
растворения. Микропипеткой наносят на бумагу 5, 10, 15 и 20 мкл 0,01 М
раствора аминокислоты порциями по 5 мкл с таким расчетом, чтобы каждая
точка будущего калибровочного графика соответствовала 0,05; 0,10; 0,15 и
0,20 мкМ аминокислоты. Установлено, что оптимальными являются 20-30 мкг
аминокислоты; в этих пределах показания прибора находятся в линейной
зависимости от концентрации окрашенных нингид-риновых комплексов
аминокислот.
Содержание аминокислот выражают обычно в процентах к массе белка или
смеси свободных аминокислот либо в процентах азота каждой аминокислоты к
азоту всего гидролизата или смеси. Выше указывалось, что точность
определения большинства аминокислот
235
составляет ±5%, а для трудно разделяемых аминокислот (серии, глицин,
валин, метионин) ± 10% [164, 407, 590, 743].
Некоторые аминокислоты нельзя определить приведенными методами: цистин и
триптофан разрушаются при кислотном гидролизе. Пролин не содержит
аминогруппы, являясь иминокислотой, и дает с нингидрином желтую окраску.
Для количественного определения этих аминокислот используют специфические
химические реакции.
VI.1.5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОНИНА
Для определения пролина готовят нингидриновый реактив, содержащий 40 мл 6
М раствора Н3Р04, 60 мл ледяной уксусной кислоты и 2,5 мг нингидрина на
каждые^ОО мл смеси. Для растворения нингид-рина смесь нагревают до 70° С
на водяной бане. Хроматограммы обрабатывают 0,02%-ным раствором
нингидрина в ацетоне. Окрашенные пятна вырезают из хроматограммы и
помещают в пробирки. В эти же пробирки добавляют по 1 мл 0,1 н. раствора
NaOH и содержимое высушивают в вакууме в течение ночи. После этого в
пробирки вливают по 1 мл уксусной кислоты и по 1 мл нингидринового
реактива. Содержимое пробирок прогревают на водяной бане при 100° С в
течение 1 ч, добавляют по 1 мл уксусной кислоты и охлаждают до комнатной
температуры. После этого розовую жидкость переносят в другие пробирки и
остатки пигмента экстрагируют из бумаги ледяной уксусной кислотой. Общий
объем жидкости доводят до определенного объема (5-10 мл в зависимости от
содержания пролина в исследуемых образцах). Оптическую плотность
определяют на спектрофотометре при 515 нм или на ФЭК-М с синим
светофильтром. После подогревания пробирок устойчивая розовая окраска
сохраняется лишь в течение часа, поэтому колориметрирование необходимо
проводить в течение этого времени [359]. Пролин определяют также методом
Швита [771].
VI.1.5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТИОНИНА
Метионин определяют методом Салливана-Мак-Карти [693]. К испытуемому
раствору (1-7,5 мл), содержащему 0,2-1,0 мг метионина, добавляют 1,5 мл 5
н. NaOH, 1,5 мл 1%-ного раствора глицина и 0,3 мл 10%-ного (масса/объем)
раствора нитропруссида натрия (соль растирают в ступке и растворяют в
воде при комнатной температуре). После добавления каждого реагента
раствор перемешивают, помещают на водяную баню при 37-40° С на 15 мин,
охлаждают на льду в течение 5-7 мин, затем в каждую пробирку добавляют по
3,0 мл 6 н. раствора НС1. Кислоту приливают по стенке пробирки, не
перемешивая. Пробирки закрывают пробками, помещают в штатив, встряхивают
в течение 1 мин и оставляют стоять при комнатной температуре 15 мин.
Измеряют интенсивность окраски против воды, используя фильтр 520 нм.
Одновременно готовят контроль на реагенты. Если исследуемая жидкость
окрашена, то к ней добавляют все реагенты, кроме нитропруссида, измеряют
интенсивность окраски контроля и исследуемой пробы против воды, а затем
из значений оптической плотности исследуемого раствора вычитают обе
поправки.
VI.1.5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА
Триптофан при гидролизе белка 6 н. раствором НС1 полностью разрушается,
поэтому его определяют методом Фюрта и Дише [142], разрушая белок с
помощью щелочи. К 2 мл раствора, содержащего
236
около 2 мг белка в 30%-ном растворе КОН, добавляют несколько капель 2,5%-
ного раствора формальдегида и 15 мл чистой 1IC1. Перемешивают, оставляют
на 10 мин, добавляют 10 капель 0,55%-ного^ раствора нитрита натрия и
доводят объем раствора до 20 мл концентрированной НС1. После фильтрации
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed