Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
по пористости агарозных гелей различной концентрации, и было найдено, что
самый разбавленный гель, который еще может быть использован для ИЭФ
(содержание агарозы 0,16%), характеризуется средним диаметром пор около
500 нм. В работе Serwer, 1980, описаны гели, приготовленные из агарозы
HGT(P) производства фирмы Miles, с концентрацией около 0,075%, что должно
соответствовать среднему диаметру пор около 800 нм.
Каким же образом агароза может формировать такую крупнопористую
структуру? Было показано, что этот полисахарид в растворе существует в
виде двойной спирали (Arnott et al., 1974; рис. 3.2, слева) и, таким
образом, имеет значительно более жесткую структуру, чем, скажем,
полиакриламидная цепь. Кроме того, от семи до одиннадцати таких спиралей
образуют длинные жесткие пучки (рис. 3.2, справа), которые переплета-
он
(И)
166
Глава 3
Агароза Сефадекс Агарозный гель
Рис. 3.2. Слева: двойная спираль агарозы, вид сбоку, перпендикулярно оси
спирали. Гидроксильные группы расположены по периметру спирали. В центре
и справа: сравнение схематически изображенных пространственных сеток
агарозного геля (справа) и сефадекса (в центре), сформировавшихся при
сходных концентрациях свободных полимерных цепей. Обратите внимание на
дополнительную агрегацию двойных спиралей в геле агарозы, которая в
значительной мере повышает прочность матрицы. (Arnott et al., 1974.)
ются между собой и формируют чрезвычайно прочную пространственную сетку
геля. Судя по всему, образование гидрофильных гелей с размером пор более
чем 500-800 нм невозможно, потому что такая структура будет разрушаться
просто под действием собственного веса. В действительности агарозный гель
представляет собой неравновесную систему, которая перестраивается с
образованием более компактной структуры. Этот процесс сопровождается
синерезисом, или частичным отторжением воды из геля при хранении.
Получать структуры с пористостью более 1 мкм можно только на основе
кремнезема, т. е. при капиллярной стабилизации в системе силикагеля
(Haller, 1965).
3.2.2. Структура и свойства полиакриламидных гелей
Полиакриламидные гели, впервые описанные Raymond, Wein-traub, 1959, и в
дальнейшем охарактеризованные в работах Огп-stein, 1964, и Davis, 1964,
принадлежат к числу самых универсальных и самых популярных матриц в
области методов электрофоретического фракционирования. Их
привлекательность обусловлена рядом важнейших характеристик, таких, как
а) оптическая прозрачность, в том числе и в ультрафиолетовой области (280
нм);
б) электронейтральность - ввиду отсутствия заряженных групп (в отличие от
крахмального геля, содержащего карбоксильные группы, и агарозного геля,
содержащего и карбоксильные, и сульфогруппы);
Аналитическое ИЭФ
167
Бис
сн2=сн __________ сн2-сн-----сн2-сн------СН2-СН-
Бис
сн2=си
' I
' с=о йн*
с-о
с~о
г^н2
с=о
NH
СН2
NM
с=о
^Н2
С=0 С-о
f4lH
с=о
сн2=сн
СН2~СН сн2-сн си2-сн-
¦снг(сн2он)3-снгон
'С-О
(CH3)2-N-CH-CH2-N-(CH5)2
,NH
Персульфат*
-+hu о
Рибофлавин
ТЕМЭД
Рис. 3.3. Химические реакции при полимеризации акриламидного геля.
Приведены структурные формулы мономеров: акриламида и М,1\Г-
метиленбисакрил-амида (бис), а также типичного "сшитого" полимерного
фрагмента. Символом i обозначены изображенные на рисунке внизу инициаторы
полимеризации- персульфат или рибофлавин (+/iv- свет), а также
катализатор Ы,Ь1,Ы',№-тетраметилэтилендиамин. (Chrambach, Rodbard, 1971.)
в) возможность варьировать размер пор в широких пределах.
На рис. 3.3 показано химическое строение ПААГ, который, как правило,
получают сополимеризацией акриламида и N, N'-метиленбисакриламида (бис).
Приведены формулы наиболее распространенных инициаторов полимеризации -
персульфата аммония (или калия) и рибофлавина, а также катализатора
полимеризации - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД).
Недавно были опубликованы работы, в которых рассматривается зависимость
кинетики полимеризации от химической природы "сшивки" (Gelfi, Righetti,
1981а), от температуры (Gelfi, Righetti, 1981b) и от эффекторов (Gelfi,
Righetti, 1981с). Различные реагенты, применяемые для образования
поперечных сшивок между полиакриламидными цепями, перечислены в табл.
3.1. Общие свойства полиакриламидных гелей обсуждаются в обзорах
Chrambach, Rodbard, 1971; Chrambach et al., 1976, и Tanaka, 1981.
Считается, что гидрофильный гель представляет собой пространственную
сетку из гибких полимерных цепей, в промежутках между которыми
макромолекулы мигрируют под действием электрического поля. Распределение
макромолекул по эффективным скоростям миграции определяется стерическими
факто-
Таблица 3.1. Структура реагентов, применяемых для "сшивки" ПААГ (По
Righettli et al., 1981)
Название Обозначение
Ы,Ы'-метиленбисак- риламид Бис (МБА)
Этилендиакрилат ЭДА
N,N'- (1,2-дигидрокси-этилен)бисакрил-амид ДГЭБА
ЧуИ'-диаллилтартар- диамид ДАТД
Ы,К',Ы"-триаллилцит- раттриамид ТАЦТ
Поли (этиленгликоль) -диакрилат-200 ПЭГ ДА200
