Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
образца.
В литературе описаны и многие другие системы аналитического или
полупрепаративного ИЭФ в градиенте плотности. Некоторые из них основаны
на применении обычной аппаратуры для электрофореза в трубках. Для
жидкостного ИЭФ применяют трубки, нижняя часть которых закрыта
полупроницаемой пробкой из агарозного (Massey, Deal, 1973) или
полиакриламидного (Behnke et al., 1975) геля или же диализной мембраной
(Hotlund, Kristenseh, 1978). В других системах в качестве разделительной
камеры используются хроматографические колонки объемом 10-15 мл (Kint,
1975) и различные варианты U-об-разных ячеек объемом 10 и 30 мл
(Osterman, 1970, Doi, Ohtsuru,
1974) или J-образных трубок (Korant, Lonberg-Holm, 1974; Azu-ma et al.,
1977).
3.2. Аналитическое ИЭФ в гелях
До тех пор пока мы ставим свои опыты по ИЭФ в поле земного тяготения, у
нас нет никаких шансов избежать "гравитационных" искажений белковых зон,
фокусируемых в свободной жидкости. В самом деле, как только белковые или
другие макромолекулы перестают быть равномерно распределенными по всему
объему проводящей жидкости и концентрируются в виде зоны, плотность в
этой зоне оказывается выше, чем в окружающем растворе. И если перепад
давления на границе такой зоны ничем не компенсируется, то неизбежно
возникают конвекционные потоки, которые стремятся свести на нет
порожденную электрическим полем неравномерность распределения вещества в
растворе. Таким образом, для того чтобы получить неискаженную белковую
зону, необходимо вводить "капиллярную" систему стабилизации, которая
предотвращает конвекционное перемешивание жидкости. Всевозможные варианты
стабилизирующих капиллярных сред были опробованы при разработке
традиционных электрофоретических методов разделения макромолекул. По-
видимому, самая первая такая система -
п*
164
Глава 3
электрофорез на бумаге - была разработана в 1939 г. в Бразилии (Von
Klobusitzky, Koning, 1973) для фракционирования яда змеи Bothrops
jararaca. В дальнейшем использовались и многие другие стабилизирующие
среды, в том числе картофельный крахмал (Kunkel, Slater, 1952),
целлюлозный порошок (Hag-lund, Tiselius,' 1950), этилцеллюлоза (Flodin,
Kupke, 1956), стеклянный порошок (Hocevar, Northcote, 1957), минеральные
соли (Strain, 1939), асбест (Butler, Stephen, 1947), силикагель (Cons-den
et al., 1946), губчатая резина (Mitchel, Herrenberg, 1957), желатина (Van
Orden, 1971) и гель поливинилового спирта (Reich, Sieber, 1966).
Перечисленные матрицы по большей части не подходят для ИЭФ, многие из них
на своей поверхности несут заряженные группы. Ввиду низкой ионной силы
рабочего раствора при ИЭФ (Righetti, 1980) наличие иммобилизованных
заряженных групп будет неизбежно препятствовать нормальному образованию
градиента pH. Последующее обсуждение ограничено только тремя типами
антиконвекционных сред, которые на сегодняшний день нашли широкое
применение для ИЭФ. Это агарозные и полиакриламидные гели и
ацетилцеллюлозные пленки.
3.2.1. Строение агарозной матрицы
Агарозой называется чистый гидроколлоидный неразветвлен-ный галактан,
выделенный из агара или непосредственно из агаробразующих морских
водорослей, в частности из красных водорослей класса Rhodophyta. Впервые
агароза была использована в качестве поддерживающей среды для зонального
электрофореза вместо применявшихся ранее агаровых гелей в работах
Hjerten, 1961, 1962. Считается, что агар представляет собой смесь
полимеров - нейтральной агарозы и заряженного агаропектина (Araki, 1956).
Было показано, что полимерная цепь агарозы образована чередующимися
остатками p-D-галак-топиранозы и З.б-ангидро-а-Б-галактопиранозы,
соединенными в цепь гликозидными связями 1-4 и 1-3 соответственно.
Строение повторяющегося звена полимера - дисахарида агаробио-зы -
показано на схеме (I):
он
(I)
На самом деле даже так называемая "нейтральная" фракция, т. е. собственно
агароза, содержит некоторое число заряженных
Аналитическое ИЭФ
165
групп, представленных остатками L-галактозо-б-сульфата (II)
и продуктами модификации галактозы пировиноградной кислотой, построенными
по типу кеталя - 4,6-(1-карбоксиэтилиден)-D-галактозы (III)
Было найдено, что "слабозаряженная" агароза (с содержанием серы от 0,99
до 0,18%) подходит для большинства электрофоретических методов
разделения, но все же не соответствует требованиям, которые предъявляет
ИЭФ. Препараты агарозы более высокого качества удается получить с помощью
хроматографической очистки на QAE-сефадексе (Johansson, Hjerten, 1974)
или на DEAE-сефадексе (Duckworth, Yaphe, 1971), а также после щелочной
обработки (Porath et al., 1971) или щелочного десульфирования в
присутствии боргидрида натрия с последующим восстановлением алюмогидридом
лития в диоксане (Laas, 1972).
Агароза более всего подходит для ИЭФ потому, что она образует гели с
необычайно крупными порами, значительно более широкими, чем поры в каком-
либо другом геле. В работе Righetti et al., 1981b, проводилась калибровка
