Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
обычного настольного калькулятора или графически, с помощью специальной
логарифмической сетки.
Другой подход, позволяющий обойтись без рассмотрения конкретной геометрии
пор, может быть сделан с помощью классической термодинамики, описывающей
распределение вещества между двумя фазами. Так, для распределения клеток
между двумя несмешивающимися жидкостями было предложено термодинамическое
описание, основанное на соотношениях типа уравнений Бренстеда
(Albertsson, 1960). Этот подход получил дальнейшее развитие в работе
Fisher, 1969, где были рассчитаны термодинамические параметры переноса
растворенного вещества между свободной жидкостью и жидкостью, связанйой с
матрицей геля!
Качественно иная термодинамическая модель (Bode, 1980) объясняет
молекулярно-ситовые явления в полиакриламидном геле исходя из свойств
гипотетической "вязкой эмульсии", состоящей из двух жидкостей с разными
коэффициентами сопротивления. В этой модели гель представляется в виде
вязко-эластичного матрикса, образованного параллельными слоями, каждый из
которых содержит подвижные полимерные цепи, формирующие некоторую сетку
неопределенной структуры. Тепловые колебания цепей происходят симметрично
относительно средней плоскости каждого слоя. Подвижность полимерных цепей
порождает силы сопротивления, направленные против внедрения какого-либо
компактного объекта, который может частично заполнить объем, ранее
доступный для полимерных цепей, подверженных тепловым колебаниям.
В действительности выбор способа описания структуры геля не имеет
большого значения. Гораздо более важный вопрос заключается в том, как
связать размер пор с реальной концентрацией (мономерного или полимерного)
материала, используемого для приготовления геля. Было предложено четыре
различных уравнения, связывающих средний диаметр пор (р) с концентрацией
геля (с) (см. рис. 3.5): р~с~°-5 (Raymond, Nakamichi, J_962), p~c~l
(Tombs, 1965), p~c-0-3 (Rodbard,Chrambach, 1970), p - c-0,7 (Righetti et
al., 1981b). Чем объяснить такое расхождение в данных различных
исследовательских групп? На самом деле взаимно противоречащими можно
считать только два первых уравнения, которые относятся к однотипным
полиакриламидным гелям с традиционным уровнем "сшивки" (3-5% С)1*-По
данным Rodbard, 1976, для гелей этого типа уравнение
11 Параметры С и Г вводятся в разд. 3.2.8. - Прим. перед.
/
172 Глава 3
p = Kd/yrc (Raymond, Nakamichi, 1962)
~p = + K" (Tombs, 1965)
PCX l/V0 (Rodward, Chrambach, 1970)
p= 140,7 c-0,7 (Righetti, Brost, Snyder, 1981)
Рис. 3.5. Уравнения, предложенные для описания зависимости между средним
размером пор* (j>) и концентрацией геля (с). Первые три уравнения были
выведены для полиакриламидных, а четвертое - только для агарозных гелей.
(Righetti, 1981.)
должно иметь вид, близкий к р~с~0'5. Два последних уравнения были
выведены для гелей_разного типа и соответственно разной структуры.
Зависимость р~с~0>3 относится к агрегированной структуре высокосшитых
полиакриламидных гелей (разд. 3.2.3). Зависимость р~с_0>7 отвечает очень
разбавленным агарозным гелям (0,16-1%), т. е. системе, организацию
которой в первом приближении можно считать идеальной. При более высоких
концентрациях полимера, таких, как в обычных полиакриламидных гелях,
могут возникнуть искажения регулярной структуры, например в результате
перепутывания цепей (Ziabicki, 1979). Таким образом, в этих системах
уменьшение размера пор с изменением концентрации может происходить
быстрее, чем это следует из нашего уравнения. Отмечалось, что предельный
размер пор в полиакриламидном геле достигает 500 нм (разд. 3.2.3), а в
агарозном геле -- 500-800 нм. Однако эти значения следует рассматривать
как динамические, а не как фиксированные величины. Поскольку
соответствующие измерения проводились с помощью заряженных частиц
латекса, мигрирующих в геле под действием электрического поля, не
исключено, что эти частицы могут механически "раздвигать" нити матрицы и
таким образом перемещаться сквозь пространственную сетку геля. При этом
истинное значение диаметра тех же самых пор может быть на самом деле
меньше, чем динамическое значение, получаемое экспериментальным путем
(Righetti et al., 1981b). Это согласуется с данными работы Gordon, 1975,
которые свидетельствуют о том, что при обычной диффузии макромолекул в
геле эффективный размер пор оказывается меньше, чем в условиях
электрофореза. Дополнительный практический вывод, который можно сделать
на основании этого наблюдения, заключается в том, что для извлечения
макромолекул из геля лучше использовать электрофоретическую элюцию, а не
чисто диффузионные методы (вазд. 4.6).
Аналитическое ИЭФ
173
3.2.3. Высокосшитые гели. Применение различных типов сшивающих
агентов
Увеличить размер пор в полиакриламидном геле можно двумя способами. Во-
первых, можно использовать очень "разбавленные" гели (минимальные
значения 7 и С равны 2 и 2,2% соответственно; Shaaya, 1976). Во-вторых,
