Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
et al., 1978) эти вещества оказываются эффективными уже в концентрации
10-50 мМ. Их действие, возможно, заключается в разделении двух
компонентов за счет встраивания на участке градиента pH между ними.
Модификация градиента pH открывает перед ИЭФ совершенно новые возможности
и позволяет повысить разрешающую способность метода до теоретически
допустимого предела. Об успешном разделении НЬА и гликозилиро-ванного
HbAic с использованием р-аланина в качестве модификатора градиента для
серийных анализов на диабет сообщалось также в работе Jeppson et al.,
1980. В некоторых случаях для улучшения разрешения на отдельных участках
градиента pH используют смеси нескольких модификаторов. Так, в работе
Cossu et al., 1982, разделение НЬА, HbF и HbFac из крови пупочного
канатика для определения талассемии у новорожденных проводилось с помощью
ИЭФ в присутствии экви-молярных количеств р-аланина и 6-аминокапроновой
кислоты. Недавно было описано проведение "разделительного ИЭФ" в
сочетании с использованием агарозной матрицы (Qureshi, Pun-nett, 1981).
Авторы разделяли изоформы ai-антитрипсина в агарозном геле, содержащем
дополнительно N- (2-ацетамид) -2-ами-ноэтансульфоновую кислоту.
Еще один вариант получения пологих градиентов pH, так называемый метод
"наложения полосок" ("strip technique"), был описан недавно в работе
Altland, Kaempfer, 1980. Этот метод основан на представлении о том, что
изменение профиля (толщины) геля вдоль градиента pH должно сопровождаться
изменением формы этого градиента. Соответствующее локальное изменение
толщины геля проще всего достичь с помощью наложения на него
дополнительной полоски геля определенной толщины и ширины на каком-либо
участке градиента. В электрическом поле амфолиты данного диапазона pi
переходят из наложенной полоски в свободную область основного геля, а
другие амфолиты, напротив, частично удаляются из основного геля, что
приводит к образованию более пологого градиента pH в геле. Примеры,
иллюстрирующие применение этого .метода, приведены на рис. 4.9 для случая
фокусирования в диапазоне pH 6-8'
208
Глава 4
V
У'А
- //>1
w
У'/,
// /
J L
/'
i
"1 I I I 1 I I Г"
J I J - L.
~777~r
/a -% ,
I ' 1 '____1____I____I /А/ I
1111
1 2 34 56 7 8 9 10 11 cm Рис. 4.9. Различные варианты модификации формы
градиента pH при наложении полосок геля толщиной 2 мм на основной гель
толщиной 350 мкм, содержащий 2%-ные сервалиты с диапазоном pH 6-8.
Расположение полосок отмечено штриховкой. Условия фокусирования: 16 вС, 4
ч, 7,5 мА (стабилизация по току), напряжение не выше 1000 В. (Altland,
Kaempfer, 1980.)
при различных вариантах расположения дополнительных полосок геля. При
наложении полоски вблизи анода в остальном геле образуется пологий
градиент pH 7,2-8, при наложении полоски, у катода - пологий градиент
6,0-7,0, а при симметричном расположении двух полосок у обоих электродов
удается сделать более пологой центральную область градиента pH
6,5-7,5. Иллюстрацией практического применения такого подхода служит
фотография на рис. 4.10, демонстрирующая постепенное улучшение разрешения
зон гемоглобинов НЬАг, НЬА и HbF при ИЭФ в пластине геля, на которую с
обеих сторон наложены постепенно расширяющиеся дополнительные полоски
геля. Для получения хороших результатов объем дополнительной полоски
должен быть не меньше полного объема основного геля,
Общие экспериментальные аспекты
209
в то же время по ширине такая полоска не должна составлять более 20-25%
от расстояния между электродами. С этой точки зрения предпочтительно
пользоваться ультратонкими основными гелями (200-300 мкм), с тем чтобы
толщина дополнительных полосок могла составлять около 1,5-2 мм. Интересно
было бы проверить, может ли совместное использование этого метода и
метода "разделительного ИЭФ" привести к получению еще более пологих
градиентов pH и, таким образом, к дальнейшему повышению разрешающей
способности ИЭФ.
Рассмотренный выше метод (Altland, Kaempfer, 1980) был независимо
"открыт" и описан в работе других авторов (Laas, Olsson, 1981), которые
назвали его "методом ИЭФ в градиенте pH с переменной толщиной геля". Эти
же авторы предложили и другую разновидность метода - "фокусирование в
градиенте pH с переменной концентрацией" (амфолитов). Сущность обоих
методов проиллюстрирована на рис. 4.11,Л,?. Следует отметить, что
последний метод не очень удобен в исполнении, поскольку требует
раздельной полимеризации нескольких секций геля, содержащих различные
количества амфолитов. Сходство обоих методов заключается в том, что в
результате неоднородности
Рис. 4.10. Постепенное уменьшение крутизны градиента pH, приводящее к
повышению разрешающей способности при ИЭФ гемоглобинов. Основной гель
толщиной 350 мкм содержит 2%-ные сервалиты pH 6-8. Клиновидные полоски
геля толщиной 2 мм с шириной у основания 2 см (с правого края) покрывают
участки основного геля, показанные штриховкой, в продолжение всего опыта.
