Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 123

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 171 >> Следующая

накладок из силиконовой резины или полиэфирной пленки, в которых
прорезаны круглые или прямоугольные отверстия (рис. 4.8). Преимущество
этого способа по сравнению с тем, при котором используются кусочки
фильтровальной бумаги, смоченные раствором образца, заключается в том,
что не происходит потери белков за счет адсорбции на бумаге.
Использование накладок не искажает равномерного распределения
электропроводности, как при внесении образцов в заранее сформированные
лунки в геле. Накладки для нанесения образцов обычно помещают недалеко от
одного из электродов, на расстоянии, составляющем 10-20% от расстояния
между электродами, и обязательно на таком участке геля, который не
пересекается с областью фокусирования образцов. Накладки можно
использовать многократно, промывая их после употребления 1N щелочью и
споласкивая водой.
В опубликованной недавно работе Cantreel et al., 1981, сообщалось, что
при ИЭФ в цилиндрических гелях внесение образца со стороны катода (в виде
тонкого слоя раствора с повышенной плотностью) вызывает искажение
градиента pH. В частности, в зависимости от содержания белка
протяженность градиента может сократиться на 1 ед. pH. Было предложенно
несколько объяснений тому, каким образом количество внесенного белка
может сказаться на искажении щелочной области градиента pH, однако ни
одно из них не кажется мне убедительным. Авторы, судя по всему, упустили
из виду наиболее вероятное объяснение. Дело в том, что образцы содержали
] [
Полоска толщиной 1 мм
Можно вносить 10-20 мкл образца в лунку
OOOOOOOOQ
Полоска толщиной 1 мм
Можно вносить 510 мкл образца в лунку
Рис. 4.8. Полоски с прямоугольными или круглыми лунками для нанесения
образцов на поверхность геля при ИЭФ, изготовленные из силиконовой
резины, (С любезного разрешения фирмы Desaga.)
296
Глава 4
5%-ный меркаптоэтанол (что соответствует концентрации примерно 0,5 М),
р/С которого находится в районе 9,5. Вполне возможно, что меркаптоэтанол
в такой концентрации перекрывает буферную емкость амфолитов-носителей
(концентрация которых в среднем едва достигает 20 мМ) и понижает pH в
катодной части геля до значений, близких к его р/С. Что касается меня, то
при ИЭФ образцов, содержащих меркаптоэтанол, я предпочитаю проявлять
осторожность и вносить образцы в гель со стороны анода. При этом мне ни
разу не доводилось сталкиваться с какими-либо искажениями формы градиента
pH или изменениями его протяженности.
4.4., Выбор градиента pH.
Получение узких градиентов pH
Из уравнений, описывающих процесс ИЭФ (Svensson, 1962а), ясно, что
хорошей разрешающей способности можно добиться при фракционировании
компонентов, характеризующихся низкими коэффициентами диффузии и сильной
зависимостью подвижности от pH вблизи изоточки. Хорошему разрешению
способствуют также высокая напряженность поля (В/см) и использование
пологого градиента pH. Последнее на практике реализуется с помощью
наборов амфолитов узких диапазонов pH, способных обеспечить рабочий
градиент pH протяженностью
1,5-2 ед. pH на всем пути разделения. Для достижения еще более высокого
разрешения используют и более узкие градиенты pH. В частности, как
уже.упоминалось, выпускаются готовые пластинки для разделения
фенотипических вариантов ai-анти-трипсина в диапазоне pH 4-5. Смеси
амфолитов, купленные или полученные самостоятельно в лаборатории, можно
подвергнуть более тонкому изоэлектрическому фракционированию (Righetti,
Drysdale, 1971; Gianazza et al., 1975) для получения наборов с рабочим
диапазоном 0,4-0,5 ед. pH. Как было показано в работе Charlionet et al.,
1979, при ИЭФ в таких диапазонах можно разделить белки, pi которых
различаются всего лишь на 0,001 ед. pH. Другой способ модификации формы
градиента pH основан на технике "разделительного ИЭФ", описанной в
работах Caspers et al., 1977, и Brown et al., 1977. Добавляя к обычному
амфолиновому градиенту pH дополнительные амфо-терные компоненты
("разделители" или "модификаторы градиента pH"; Beccaria et al., 1978),
удается изменить форму градиента, как правило, с образованием пологих
участков в области pi добавленного компонента. В качестве "модификаторов
градиента pH" использовались следующие вещества: тетраглицин
(pi 5,2), пролин (pi 6,3), р-аланин (pi 6,9), 5-аминовалериано-' вая
кислота (р! 7,5), 4-аминомасляная кислота, 7-аминокапри-
Общие экспериментальные аспекты
297
ловая кислота, гистидин (pi 7,6) и 6-аминокапроновая кислота (pi 8,0).
Все они, за исключением гистидина, являются "плохими" амфолитами-
носителями (значение pi-р/( около 3-4) и поэтому в амфолиновом градиенте
pH фокусируются в виде широких плато. Для существенного изменения формы
градиента pH концентрация этих соединений должна быть достаточно высока -
обычно порядка 0,3-0,6 М. В то же время в случае хороших амфолитов типа
His (или дипептида His-Gly, который был успешно использован для
разделения НЬА и его минорной гликозилированной формы HbAic, см Beccaria
Предыдущая << 1 .. 117 118 119 120 121 122 < 123 > 124 125 126 127 128 129 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed