Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 128

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 171 >> Следующая

в диапазоне 600-900 (Bianchi Bosisio et al., 1981), казалось бы, несложно
решить эту задачу с помощью обычного диализа. Однако с использованием
[14С|-амфолинов было найдено, что для полного их удаления диализом
требуется не менее 32 ч даже при диализе против 0,1 М. фосфатного буфера
pH 7, содержащего 0,5 М NaCl (Vesterberg,. 1970). В работах Nilsson et
al., 1970, и Li, Li, 1973, было показано, что амфолиты удается весьма
эффективно отделить с помощью осаждения белков сульфатом аммония в
диапазоне концентраций 60-100% (от насыщения). После центрифугирования
белковый осадок трижды промывают тем же раствором' (NH4)2SO4. Судя по
всему, все амфолиты растворимы вплоть до содержания соли,
соответствующего 100%-ному насыщению,, и, таким образом, могут быть
удалены полностью. Хорошего отделения белков от амфолитов удавалось также
достичь при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50 (fine) в колонке,
уравновешенной 0,1М фосфатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl (Quast,
Vesterberg, 1968). Можно использовать также и другие буферные растворы,
такие, как 0,1 М аммонийбикарбонат или 0,1 М имидазолацетат с pH около 7
. Преимущество аммо-нийбикарбонатного буфера заключается в том, что он
летуч и может быть удален при лиофилизации. Независимо от конкретного
метода разделения, очень важно проводить его при высокой ионной силе
буферного раствора (0,1-0,5М соль), с тем чтобы произошла диссоциация
относительно непрочных комплексов, образующихся между белками и
амфолитами за счет электростатических взаимодействий.
В работе Brown, Green, 1970, предложен альтернативный метод разделения
белков и амфолитов-носителей на ионообмен-нике смешанного типа (Bio Rad
AG 501-Х8). Этот метод, видимо, можно считать наиболее совершенным, так
как, по данным Baumann, Chrambach, 1975, полученным с использованием
(14С)-меченых амфолитов, после хроматографии на бифункциональной смоле
остаточное содержание амфолитов не превышает 0,005 моля на 1 моль белка.
Такое разделение можно с уверенностью назвать количественным.
Существуют также методы электрофоретического удаления амфолинов,
использованные, в частности, в работах Suzuki et
20*
308
Глава 4
Рис. 4.13. Схема, иллюстрирующая устройство системы электрофоретической
элюции сфокусированных белков. Белок концентрируется в небольшом
пространстве между фильтром и диализной мембраной. Амфолиты-носители
свободно проходят через мембрану. 1 - электрод, 2 - буфер, 3 - диализная
мембрана, 4 - фильтр, 5 - сегменты геля. (Stathakos, 1975.)
al., 1973, и Stathakos, 1975, для извлечения белков из ПААГ после
препаративного ИЭФ в геле. Белок вместе с амфолитами-носителями
подвергается электрофоретической элюции из геля в камеру, на дне которой
находится диализная мембрана. Ам--фолины проходят через мембрану, а белок
задерживается в камере, и его удается получить с высоким выходом в виде
концентрированного раствора, свободного от амфолинов (см. рис. 4.13, а
также разд. 2.2.4 и 2.2.5). Для отделения амфолитов от белков можно
использовать также ультрафильтрацию или диализ в полых волокнах
(поставляется фирмой Bio Rad). Для обнаружения небольших примесей
амфолитов-носителей (порядка микрограмм) в полученных после ИЭФ белковых
препаратах было предложено использовать тонкослойную хроматографию
(Bloomster, Watson, 1981). Образцы наносят на тонкослойную целлюлозную
пластинку и проводят хроматографию в 10%-ной ТХУ. Белки и другие
высокомолекулярные компоненты выпадают в осадок и остаются на старте, а
примесные амфолиты мигрируют, образуя диффузные нингидрин-положитель-ные
зоны с R/>0,5. Эти же авторы описали еще один способ удаления амфолинов -
электродиализ в солевом ацетатном буфере pH 4,0 в течение 4 ч. По-
видимому, удаления амфолитов-носителей можно добиться и с помощью
гидрофобной хроматографии на фенил- или октил-сефарозе - так, как это
было сделано в работе Vesterberg, Hansen, 1978, для концентрирования и
обессоливания белков из физиологических жидкостей (в част-
Общие экспериментальные аспекты
309
иости, белков мочи). Амфолиты весьма гидрофильны и, следовательно, не
будут связываться с' сорбентом. Хотя подобный метод, по-видимому, можно
использовать для отделения белков от амфолинов, он, как показано в работе
Gelsema et al., 1980, оказывается непригодным при работе с пептидами.
4.7. Возможные модификации белков в ходе ИЭФ
В работах Jacobs, 1971, 1973, впервые сообщалось о частичной модификации
цистеина и метионина до цистеиновой кислоты и метионинсульфоксида, а
также о частичной потере тирозина и аргинина при продолжительном ИЭФ
бычьей рибонукле-азы. Оба этих эффекта удавалось в значительной мере
устранить удалением из колонки растворенного Ог и добавлением
антиоксидантов типа тиодигликолевой и аскорбиновой кислот. В работах
Satterlee, Snyder, 1969, и Quinn, 1973* сообщалось о восстановлении Ре^-
миоглобина до оксигемоглобина в процессе ИЭФ. В свете известной
склонности миоглобина к аутоокислению, а также окислительных свойств
Предыдущая << 1 .. 122 123 124 125 126 127 < 128 > 129 130 131 132 133 134 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed