Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
5,45 Nakhleh et al, 1972
5,35 Conway-Jacobs, Lewin, 1971
3,60 Conway-Jacobs, Lewin, 1971
3,05 Conway-Jacobs, Lewin, 1971.
ной компонент) Патентованный голубой V
3,00 Conway-Jacobs, Lewin, 197L
') Трнс(5-гидрокси-1,10-фенантролин)-железо(Н).
2) Смешанный комплекс между трис(5-гидрокси-М0-фенантролин)-железом(Н) и
трис* (4-гидрокси-1,10-фенантролин)- железом (II).
3) Смешанный комплекс между трис(4-гидрокси-1,10-фенантролин)-железом
(II) и трис-(5-гидрокси-1,10-фенантролин)-железом (II).
*) Трис(4-гидрокси-1,10-фенантролин)-железо(11).
б. В среднем величина отклонения для амфолинов (и, вероятно, для белков)
в диапазоне 3<рК9 при ИЭФ в градиенте-концентрации сахарозы 0-60% не
превышает ±0,1 ед. pH.
в. Коэффициенты температурной зависимости для pi амфолинов (и, вероятно,
белков) хорошо коррелируют с относительным содержанием карбоксильных и
аминогрупп.
г. Влияние среды на pi амфолинов, отражаемое зависимостью pi*-pi от
концентрации сахарозы, глицерина или этиленгликоля, хорошо согласуется с
влиянием тех же параметров, на величину рК*-р/f в случае карбоновых
кислот и алкилзаме-щенных аминов.
д. Значения р1Каж-pi, определенные для амфолинов, можно, использовать в
качестве поправки для соответствующих значений р1Каж белков, определяемых
с помощью ИЭФ в градиенте плотности.
Для коррекции значений pi, полученных при ИЭФ в градиенте плотности,
содержащем 6М мочевину, в работе Ui, 1971,. предлагается вычитать из
соответствующих значений величину 0,42 ед. pH. В работе Josephson et al.,
1971, в качестве поправок при ИЭФ в 7М мочевине рекомендуются величины
0,7- 0,9 ед. pH. Другие авторы (Gianazza et al., 1977) показали, что
влияние мочевины при ИЭФ зависит от конкретного рабочего диапазона pH и
может быть количественно выражено величиной, изменяющейся от 0,05 до
0,075 ед. pH на 1 ед. молярности мочевины при переходе от кислых
амфолинов к щелочным. Эта
20-1488
зов
Глава 4
данные согласуются и с выводами, сделанными в работе Gelse-jna, DeLegny,
1977, о некорректности использования одной и той же поправки для
наблюдаемых значений pi независимо от конкретной области pH
фокусирования.
Для измерения pH в цилиндрических гелях было принято разрезать гель на
сегменты длиной 2-5 мм и элюировать из них амфолиты в 200-300 мкл 10 мМ
КС1. Недавно эту операцию удалось заменить автоматическим pH-
сканированием при .помощи контактного микроэлектрода (типа Ingold № Е
547310-1), смонтированного на механическом приводе, который перемещает
электрод вдоль поверхности цилиндрического геля, помещенного в
специальный желобок в пластиковом блоке (Chidakel et -al., 1977).
Сканирование геля проводится со скоростью 1 см/1,5 мин; значение pH
автоматически регистрируется на ленте само-лисца. В пластинах геля pH
можно измерить непосредственно на поверхности с помощью электрода с
плоской мембраной типа LOT 403-30-М8 фирмы Lngold (диаметр мембраны 6
мм). При этом точки, в которых фиксируются значения pH, можно пометить,
проделав в геле отверстия диаметром 1-2 мм (Rig--hetti, Caravaggio,
1976). Первоначально для этих целей были предложены сурьмяные электроды
(Beeley et al., 1972), которые в настоящее время практически не
используются ввиду плохой воспроизводимости и отклонения от "нернстовых"
свойств. Недавно было описано применение иридиевого микроэлектрода
(Papeschi et al., 1976; Gianazza et al., 1977), изготовленного в виде
иглы с кончиком толщиной 0,2-0,5 мм. Этот микроэлектрод является истинным
"нернстовым" электродом с линейной зависимостью потенциала от pH и
температуры. Это, по-видимому, единственный микроэлектрод, пригодный для
измерения pH при 4'°С, т. е. при обычной температуре ИЭФ (при
использовании других микроэлектродов перед измерением pH гель приходится
нагревать до комнатной температуры).
В заключение остановимся на специфических проблемах, возникающих при
сопоставлении значений pi, полученных при ИЭФ в градиенте плотности и в
геле. Давно известно, что для целого ряда щелочных белков, в частности
цитохрома с (Radola, 1973а; Bobb, 1973), химотрипсиногена (Salaman,
Williamson, 1971), рибонуклеазы феПпсёе, Radola, 1975) и субтилизина
(Wadstrom, Smyth, 1975), значения pi, полученные с помощью ИЭФ в плоском
геле, оказываются значительно ниже (на 1-2 ед. pH), чем соответствующие
значения, полученные при ИЭФ в градиенте плотности. Было установлено, что
это различие вызвано связыванием С02 из воздуха открытой поверхностью
плоского геля (Delincee, Radola, 1978). Влияние С02 особенно велико в
области pH выше 8,2-8,3. При тонкослойном ИЭФ в атмосфере, свободной от
С02, и последующем измерении pH
Общие экспериментальные аспекты
307
(также в отсутствие СОг) оказывается, что наблюдаемые значения pi
щелочных белков прекрасно согласуются с данными ИЭФ в градиенте
плотности.
4.6. Удаление амфолитов-носителей после ИЭФ
После ИЭФ часто возникает необходимость отделить белковые фракции от
амфолитов-носителей. Поскольку у большинства амфолитов значения Afr лежат
