Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 125

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 119 120 121 122 123 124 < 125 > 126 127 128 129 130 131 .. 171 >> Следующая

Образцы (слева направо): 1, 2 и 4 - по 15 мкл лизата эритроцитов
взрослого человека; 5 - аналогичный препарат из эритроцитов
новорожденного; 3 - смесь равных количеств препаратов 1 и 5; 6 (длинная
полоса) - смесь препаратов 1 и 5 в соотношении 3 :1. Условия опыта:
температура 16 °С, префокусирование 30 мин, постоянный ток 7,5 мА,
предельное напряжение 1000 В; фокусирование образцов - 5 ч, постоянное
напряжение 1000 В.
(Altland, Kaempfer, 1980.)
300
Общие экспериментальные аспекты
А
(,") (е)
Б
Рис, 4.11. А. Схема, иллюстрирующая принцип фокусирования в градиенте pH
с переменной толщиной геля, (а) - обычное ИЭФ в геле с постоянной
толщиной; (б) - ожидаемое изменение формы градиента pH при уменьшении
толщины слоя в центральной части геля. Заштрихованные участки в обоих
случаях составляют одну и ту же часть от общего объема каждого из гелей и
содержат один и тот же набор амфолитов-носителей. Отмечены ожидаемые зоны
фокусирования двух гипотетических белков 61 и 62 со значениями изоточек
pHi и рН2 соответственно. Б. Схема, иллюстрирующая принцип фокусирования
в градиенте pH с переменной концентрацией амфолитов. (а) - обычный
градиент pH, образующийся при равномерном концентрационном распределении
амфолитов по всему рабочему объему; (б) -ожидаемая форма градиента pH для
случая, когда в левой половине геля концентрация амфолитов-носителей
втрое выше, чем в правой. Отмечены положения гипотетических белков 61 и
б2 с изоточками pHi и рН2 соответственно. АН - амфолиты-носители, (L??s,
Olsson, 1981.)
Общие экспериментальные аспекты
301
геля в определенной зоне градиент напряженности поля оказывается
значительно выше, чем в остальных участках геля, что приводит к резкому
сужению белковых полос при миграции через эту зону. По-видимому, можно
было бы скомбинировать все три методических подхода (ИЭФ в
модифицированном градиенте pH, ИЭФ в градиенте pH с переменной толщиной
геля и ИЭФ ¦с переменной концентрацией амфолитов) и достичь еще более
высокого разрешения, которое позволило бы решать еще более сложные
аналитические задачи.
4.5. Измерение градиента pH
pi белка, определенное с помощью ИЭФ, соответствует его изоионной точке в
отсутствие комплексо-образующих ионов. По определению изоионная точка -
это мера собственной кислотности чистого белка, поскольку ее значение
определяется как такое значение pH раствора, которое остается неизменным
после добавления к нему небольшого количества чистого белка (Sorensen et
al., 1926). Это определение подходит и в случае ИЭФ "белка, поскольку
положение (и pH) сфокусированной зоны, как известно, не изменяется при
увеличении содержания белка в зоне. Значения pi, определяемые с помощью
ИЭФ, зависят от температуры и с ее увеличением, как правило, уменьшаются
(Vesterberg, Svensson, 1966). Разность между значениями pi одного и того
же белка, измеренными при 25 и 4 °С, может достигать 0,5 ед. pH.
Понижение температуры ниже 4СС сопровождается дальнейшим повышением
наблюдаемого pi белка. Это различие проявляется наиболее отчетливо для
щелочных белков.
Таблица 4.1. Значения рК и Atft°, использованные для расчета
температурного сдвига pi у модельных белков (Fredriksson, 1977)
Ионизируемая группа р/С (25 °С) АЯЛ кк ал/моль P/С <4"С)'> ДрК
Карбоксильная 4,50 1 4,56 0,06
Имидазольная 6,50 7 ' 6,89 0,39
а-Амино- 7,80 10 8,36 0,56
Фенольная " 9,80 6 10,13 0,33
"-Амино- 10,00 12 10,67 0,67
0 Рассчитано по уравнению Вант-Гоффа исходя из известных значений ДHf.
A#i° - стандартная теплота ионизации.
302
Глава 4
а также для белков, значения pi которых близки к р/С каких-либо их
функциональных групп. В самом деле, все протолити-ческие группы белков,
за исключением карбоксильных групп* характеризуются довольно большой
стандартной теплотой ионизации (AHi0 лежит в диапазоне 6-14 ккал/моль;
см. табл. 4.1). Поэтому изменение значений рК в температурном интервале
4-25'°С будет очень мало для карбоксилов (Ар/С = 0,06), достаточно велико
для имидазольных групп (Ар/С = 0,39) и очень велико для е-аминогрупп
лизина (Др/С = 0,67) (Tanford, 1962; Bull* 1971). Таким образом, можно
полагать, что у нейтральных и щелочных белков величина dpi/dТ будет
достаточно высока. Экспериментально было показано, что кривые зависимости
ДрН и Др1 от pi (см. рис. 4.12) для амфолитов-носителей и белков
соответственно идут параллельно только в диапазоне pH ниже 5 и заметно
расходятся в области pH 5-9, главным образом благодаря вкладу
функциональных групп His и Lys в белках (Fredriksson, 1977). Как видно из
рис. 4.12, соответствующие кривые пересекаются в области pH 7,4. Именно
это обстоятельство позволило утверждать, что значения pi для миоглобина
лошади, определенные при 4 и 25°С, совпадают (Vesterberg, Svensson,
1966). В то же время для большинства белков это,
Рис. 4.12. Разность значений pi (Др1) при двух температурах, 25 и 4°С,
для некоторых модельных белков в зависимости от pi при 4°С. В рамках
Предыдущая << 1 .. 119 120 121 122 123 124 < 125 > 126 127 128 129 130 131 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed