Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
можно вносить в колонку как до, так и после образования градиента pH. В
первом варианте перед началом ИЭФ можно равномерно распределить образец
по всему объему колонки или внести в виде достаточно узкой зоны в
предполагаемую область его фокусирования. Часто отдают предпочтение
последнему методу, поскольку он позволяет сократить время фокусирования и
избежать нежелательного контакта образца с анолитом и католитом. Внесение
образца при этом осуществляется следующим образом: в колонку наслаивают
рабочий градиент плотности до того уровня, на котором ожидается
фокусирование образца, далее следующие порции градиентного раствора
последовательно заливают в три пробирки (см. рис. 4.6): 0,5 мл (в 1-ю
пробирку), 3 мл (во 2-ю пробирку) и 0,5 мл (в 3-ю пробирку) для колонки
объемом 110 мл или 1,0, 10,0 и 1,0 мл в 1, 2 и 3-ю пробирки
соответственно для колонки объемом 440 мл. К раствору во 2-й пробирке
добавляют образец, осторожно перемешивают, а затем растворяют
дополнительно несколько кристалликов сахарозы, с тем чтобы плотность
Общие экспериментальные аспекты
293
раствора оказалась выше, чем в 3-й, но ниже, чем в 1-й пробирке. В том
случае, если плотность подобрана правильно, капля раствора из 1-й
пробирки должна опускаться на дно, а из
3-й - всплывать к поверхности раствора во 2-й пробирке. После этого
содержимое 2-й пробирки вносят в колонку и продолжают наслаивание
градиента (рис. 4.6).
Однако часто оказывается более предпочтительным вносить образец в уже
сформированный градиент pH, с тем чтобы уменьшить время контакта с
амфолинами, например в случае ИЭФ металлозависимых ферментов или
компонентов, подверженных дестабилизации или инактивации в изоточке, в
частно-^ сти при ИЭФ целых клеток. С этой целью в работе Sherbet,
Lakshmi, 1973, была предложена модификация колонки фирмы LKB 8100-1 с
использованием впаянного в середину колонки специального бокового отвода
с перегородкой. После префоку-сирования образец через этот отвод вносят в
середину градиен-
Рис. 4.6. Внесение образца в колонку для препаративного ИЭФ. А. Образец
равномерно распределен по всему объему градиента. Б. Образец внесен в
виде узкой зоны вблизи предполагаемой области его фокусирования в
процессе наслаивания градиента плотности. Для этого после заполнения
колонки до определенного уровня рабочий раствор от смесителя подают,
последовательно в три пробирки (0,5, 3 и 0,5 мл в случае колонки объемом
110 мл и 1,0, 10 и 1,0 мл - для колонки объемом 440 мл; пробирки 1, 2 и 3
соответственно). Образец растворяют в центральной пробирке, плотность
полученного раствора корректируют так, как это описано в тексте. Затем
раствор образца переносят в колонку и поверх него наслаивают остаток
градиента плотности. В. Внесение образца в сформированный градиент pH. В
этом случае три пробирки заполняют (так же, как в случае Б) раствором,
который откачивают с определенного участка градиента в колонке. Образец
растворяют в центральной пробирке, корректируют плотность раствора и
закачивают его обратно в колонку. (С любезного разрешения LKB Produkter
АВ.)
294
Глава 4
Образец
1 2 3 4
Рис. 4.7. Система внесения образца для ИЭФ клеток. Рубашка внутреннего
охлаждения изготовлена в виде "пальца", верхняя половина которого состоит
из двух концентрических цилиндров. Суспензию клеток подают во внутреннюю
цилиндрическую трубку, нижний конец которой через четыре отвода
соединяется с наружной поверхностью "пальца". Меняя глубину погружения
"пальца" в колонку, суспензию клеток можно вносить в заранее выбранную
область градиента. (Boltz et al., 1978.) '
та, после чего его разделение занимает всего лишь 2-3 ч (см. также гл.
5). Для внесения образца в самодельную колонку, описанную в работе Boltz
et al., 1978, использовалась специальная трубка в рубашке внутреннего
охлаждения (рис. 4.7). Суспензию клеток подавали в колонку через четыре
отверстия в стенке рубашки, с которыми соединяется вышеупомянутая трубка.
Участок градиента, на который вносится образец, можно выбирать, изменяя
глубину погружения рубашки охлаждения, изготовленной в виде "пальца" со
свободой перемещения по вертикали. Можно пользоваться и более простым
методом - после образования градиента pH через отверстие вверху колонки
вводят тонкую трубочку до того уровня, на который желательно нанести
образец, через неё откачивают 4 или 12 мл рабочего раствора (для колонок
объемом 110 или 440 мл соответственно) ; этот раствор разливают по трем
пробиркам и в одну из них добавляют образец так же, как это было описано
выше. После соответствующей подгонки и проверки плотности раствора
образца его закачивают обратно в колонку через ту же трубочку
Общие экспериментальные аспекты
295
(рис. 4.6). Затем трубочку вынимают и проводят фокусирование образца.
Говоря о фокусировании в плоских гелях, помимо методов внесения образца,
рассмотренных в гл. 3 (см. рис. 3.20), следует упомянуть о -наиболее
эффективном на сегодняшний день способе, основанном .на применении
