Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 126

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 171 >> Следующая

указано гипотетическое содержание протолитических групп в двух модельных
белках. Число е-аминогрупп (я) в каждом случае заранее не уточняется, а
подбирается таким образом, чтобы модельный белок характеризовался
заданным значением pi (4,0; 4,5 и т. д.) при 4 °С. При этом в общем
случае п оказывается нецелым числом. Точки 1-3 соответствуют модельным
белкам с р1 = 6,5 при 4 °С, содержащим 1, 2 и 3 имидазольные группы
соответственно. Кроме того, на рисунке приведены точки, отвечающие
смещению pH (ДрН), которым сопровождается нагревание изоэлектрических
(при 4°С) фракций амфолитов от 4 до 25°С (рассчитано на основании данных
Davies, 1970). (Fredriksson, 1977.).
Общие экспериментальные аспекты
303
конечно, не так. Как правило, следует ожидать, что значения pi,
определенные при 4РС, окажутся выше, чем при 25 °С. Для сильнокислых
белков значение dpi/dТ вблизи 4*°С в среднем должно составлять около -
0,005 (ед, pH на градус), а для сильнощелочных - около -0,03. В работе
Fredriksson, 1978, были приведены таблицы, позволяющие перевести значения
pi, полученные в результате фокусирования при 4РС и измерения pH при
25°С, в истинные значения pi при 4РС. Эти таблицы составлены на основе
экспериментальных данных по температурному смещению pi для определенных
фракций амфолинов, сфокусированных в сахарозном градиенте плотности, при
изменении температуры от 4 до 25|0С.
Располагая хорошим набором маркеров с известными значениями pi при 4 и
25°С, можно обойтись без трудоемкой процедуры измерения pH после ИЭФ. В
ряде работ опубликованы таблицы, иллюстрирующие возможности применения
различных белков и красителей в качестве рН-маркеров при ИЭФ (Bours,
1973d; Radola, 1973а; Righetti, Caravaggio, 1976; Conway-Jacobs, Lewin,
1971; Nakhleh et al., 1972). Во избежание неоднозначности в идентификации
зон белковые маркеры должны быть гомогенны или по крайней мере содержать
один преобладающий тегко идентифицируемый компонент. Весьма
привлекательным представляется использование в качестве маркеров
красителей, но, к сожалению, многие из них, особенно сульфопроизводные,
активно взаимодействуют с амфолитами-носителями. Это проявляется в
образовании множественных зон, отвечающих различным комплексам краситель-
амфолит (Righetti et al., 1977). Перечень некоторых рН-маркеров приведен
в табл. 4.2. В настоящее время подобные наборы маркеров поставляются
многими фирмами (Pharmacia, BDH и др.).
Для измерения pH после ИЭФ в градиенте плотности в ряде работ были
предложены различные конструкции проточной кюветы для непрерывной
регистрации pH в элюате (Jonsson et al., 1969; Secchi, 1973; Strongin et
al., 1973). Профиль pH может записываться на той же ленте, что и профиль
УФ-поглоще-ппя; это облегчает процесс идентификации пиков. В работах
Gelsema, De Ligny, 1977, и Gelsema et al., 1977, 1978, подчеркивалось,
что при использовании различных добавок (особенно при ИЭФ в градиенте
плотности) следует ввести ряд поправок, корректирующих определяемое
кажущееся значение р1Каж. Основные положения, выдвинутые авторами, можно
кратко сфор-ь улировать следующим образом:
а. Отклонение от истинного значения (р1Каж-pi) при традиционном ИЭФ в
градиенте плотности зависит от кислотности, основности и химического типа
амфолита, а также от состава растворителя.
Таблица 4.2а. pH-маркеры для изоэлектрофокусирования
Белки pi при 25 вС Литературный источник pi при 25 °с
Литературный источник pi при 4 eC Литературный источник
Цитохром С Рибонуклеаза Миоглобин кашалота основной компонент минорный
компонент 9,28±0,02 8,88±0,03 8,18 ± 0,02 7,68±0,02 Radola, 1973а
Radola, 1973а Radola, 1973а Radola, 1973а 8,18±0,04 Nakhleh et al.,
1972
Миоглобин лошади
основной компонент 7,33±0,01
минорный компонент 6,88±0,02
Бычий гемоглобин А 6,80
Бычья карбоангидраза
Кональбумин 5,88±0,02
Р-Лактоглобулин В 5 31
р-Лактоглобулин А 5,14±0,01
Бычий инсулин 5,32 ±0,02
Бычий альбумин ция V Кона) Овальбумин
(фрак- 4,90 4,70
Ферритин I из селезенки 4,50±0,02 лошади
Ферритин II из селезен- 4,38±0,02 ки лошади Ферритин III из селезен-
4,23±0,03 ки лошади
Radola, 1973а Radola, 1973а
Conway-Jacobs, Le-win, 1971
Radola, 1973a
Radola, 1973a Radola, 1973a Conway-Jacobs, Le-win, 1971 Conway-Jacobs,
Lewin, 1971 Conway-Jacobs, Lewin, 1971
Radola, 1973a Radola, 1973a Radola, 1973a
7,45±0,04 Nakhleh et al., 1972 7,58±0,02
7,15 Nakhleh et al., 1972 2,22±0,05
6,18±0,02
5,45±0,02
5,35
Bours, 1973d Bours, 1973d
Bours, 1973d Bours, 1973d Bours, 1973d
4,95±0,02 Bours, 1973d
Общие экспериментальные аспекты
305:
Таблица 4.26. рН-маркеры для изоэлектрофокусирования
Красители
pi при 25 °С
Литература
Трис(5-ОН)- железо(П) *>
Бис (5-ОН) -4-ОН--желе-зо(П)2)
Бис (4-ОН) -5-ОН-железо^)3)
Конго красный Трис(4-ОН)-железо (П)4) Голубой Эванса Метиловый голубой
Быстрый зеленый FCF (основ-
7,15 Nakhleh et al, 1972
6,82 Nakhleh et al, 1972
6,24 Nakhleh et al, 1972
5,80 Conway-Jacobs, Lewin, 1971;
Предыдущая << 1 .. 120 121 122 123 124 125 < 126 > 127 128 129 130 131 132 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed