Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
В данной главе мы рассмотрим: 1) отбор, клонирование и условия культивирования, позволяющие сохранять функцио-
270 Глава 16
нальную активность специфических аллореактивных Т-клеток; 2) характеристику Т-хелперных клонов; 3) разработку хелпер-ного теста, предназначенного для определения частоты возникновения В-клеток, индуцированных к выработке данного изотипа антитела.
II. МАТЕРИАЛЫ
А. Среда и добавки
Во всех случаях использовали среду RPMI 1640, забуферен-ную бикарбонатом, которая в виде добавок содержит L-глута-мин (2 мМ), заменимые аминокислоты (1%), пируват натрия (1%), гентамицин (50 мкг/мл) (все реагенты фирмы Flow Laboratories, Irvine, Англия) и 2-МЭ (5-10-5 М) (полная RPMI). В среду для культивирования добавляли или 10% СПК, или 5% сыворотки крови человека (СКЧ). Партии СПК отбирали в соответствии с их способностью поддерживать включение тимидина (в тесте на пролиферацию) и образование иммуноглобулинов (в хелперном тесте; см ниже). Культуры инкубировали при 37 °С и 5% С02 в воздухе. Клетки промывали или средой RPMI, забуференной ГЭПЭС, или сбалансированным солевым раствором Хэнкса (СРХ).
Б. Интерлейкин-2 (ИЛ-2)
В прошлом в качестве источника ИЛ-2 мы использовали супернатанты культуральных сред от клеток миндалин, стимулированных ФГА. В целях уменьшения опасности бактериального и грибкового заражения была разработана следующая методика. Миндалины, полученные при тонзилэктомии от нескольких доноров, погружают на 30 с в абсолютный этанол и затем интенсивно отмывают в СРХ. Для получения суспензии, состоящей из отдельных клеток, ткань разрушают иглами в чашке Петри, содержащей СРХ с антибиотиками. Большие клеточные агрегаты удаляют отстаиванием суспензии в течение
3 мин. Клеточную суспензию наслаивают на градиент Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Швеция) и центрифугируют 30 мин при 400 g. Клетки, находящиеся на границе раздела,, собирают, дважды промывают, ресуспендируют в небольшом объеме СРХ и наслаивают на градиент СПК (7 мл в центрифужной пробирке на 10 мл). Пробирку центрифугируют 5 мин при 800 об/мин; бактерии и разрушенные клетки остаются на границе раздела. Надосадочную жидкость отбрасывают, а клетки суспендируют в СРХ. Эту процедуру повторяют трижды. Наконец, клетки ресуспендируют в концентрации 4-106 кле-
Выделение клонов адлореактивных Т-хелперов
271
ток/мл в полной среде RPMI, которая содержит 4% инактивированной нагревание^ СКЧ группы АВ и 1 мкг/мл лейкоагглю-тинина (Pharmacia). После культивирования во флаконах в течение 40 ч суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость фшльтруют через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм и хранят при 4 °С. Каждую новую партию материала необходимо проверять на содержание ИЛ-2 и присутствие микоплазмы.
В настоящее время имеется несколько доступных источников гомогенного ИЛ-2, который производят с помощью технологии получения рекомбинантных ДНК (рекомбинантный ИЛ-2). При применении ИЛ-2 (Biogen SA, Geneva, Швейцария и Roche, Nutley, США) для стимуляции роста клонов Т-хелперов в течение более чем одного года были получены результаты, не уступающие, а иногда и превосходящие те, которые давало использование надосадочной жидкости от клеток миндалин.
Активность ИЛ-2 измеряют в пролиферативном тесте, используя в качестве ИЛ-2-зависимых клеток мышиный клон СТ44 (Gillis et al., 1978). За единицу активности на 1 мл принимают концентрацию интерлейкина, при которой индуцируется 50% максимального пролиферативного ответа клеток СТ44 в стандартных условиях.
В. Среда для роста Т-клеток (GM)
Для того чтобы обеспечить антиген-независимый рост Т-клеточных клонов, в среду RPMI — СПК добавляют 5—20% (по объему) надосадочной жидкости от ФГА-активированных клеток миндалин, так что концентрация ИЛ-2 в среде становится равной по крайней мере 10 ед./мл.
Если доступен рекомбинантный ИЛ-2, то можно (и даже предпочтительно) использовать более высокие его концентрации. Оптимальные результаты получают при концентрации ИЛ-2 40 ед./мл.
СКЧ содержит питательные факторы, которые способствуют размножению клеток, стимулированных ИЛ-2. Поэтому в случае использования рекомбинантного ИЛ-2 в среду добавляют также 1 % СКЧ.
Г. Клеточные суспензии
Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяют из гепаринизированной венозной крови с помощью центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque (Pharmacia).
Клеточные суспензии, лишенные Т-клеток («не Т-клетки»), получают методом отрицательной селекции, удаляя клетки, образующие розетки с БЭ, центрифугированием в градиенте
272 Глава 16
Ficoll-Hypaque (Lanzavecchia et al., 1983). В-лимфоциты идентифицируют путем прямого окрашивания клеток конъюгированными с флуоресцеином козьими антителами, специфичными к Р(аЬ/)2-фрагментам антител человека.
Д. Источник клеток-стимуляторов
Размножение in vitro клонов специфических аллореактив-ных Т-клеток зависит от их периодической повторной стимуляции исходным аллоантигеном. Целесообразно поэтому заморозить несколько аликвот использованных первоначально МПК (около 107 клеток на ампулу). Для повторной стимуляции ал-лореактивных клонов удобны также лимфобластоидные клеточные линии (ЛКЛ), полученные при трансформации клеток того же донора вирусом Эпштейна — Барра (ВЭБ). Они могут быть получены следующим образом: МПК (Ю6 клеток/мл)
