Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 107

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 239 >> Следующая

IV. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
В нашей лаборатории мы на протяжении трех последних лет воспроизводимо получаем аллореактивные Т-хелперные клоны, используя различные аллогенные клонированные СКЛ. Большая часть полученных клонов (обычно более чем 50%) имела свойства Т-хелперных клеток, судя по тому, что такие клоны пролиферировали в ответ на первоначальный стимулятор в отсутствие экзогенного ИЛ-2 и проявляли хелперные функции как по отношению к В-клеткам, так и по отношению к цитоток-сическим предшественникам (Lanzavecchia, 1983; Ramarli et
Выделение клонов аллореактивных Т-хелперов
277
al., 1984). Нужно отметить, что некоторые цитотоксические •клоны могут пролиферировать и вырабатывать ИЛ-2 в тех же •самых условиях рестимуляции, что и Т-хелперы. Вместе с тем между индивидуальными клонами были обнаружены количественные различия как в отношении ростового потенциала, так я в отношении хелперных свойств. Следовательно, для получения достоверных результатов необходим широкий скрининг и титрование хелперных клеток.
Описанная методика отбора и выращивания Т-клеток согласуется с современными представлениями о физиологии Т-кле-ток. Контакт со специфическими аллоантигенами клеток-стимуляторов индуцирует Т-хелперные клетки как к интенсивной экспрессии рецепторов для ИЛ-2, так и к выработке этого лимфокина, что приводит к нескольким циклам аутостимуляции (Meuer et al., 1984). Некоторое время пролиферацию можно поддерживать добавлением экзогенного ИЛ-2, однако спонтанная «обратная регуляция» рецепторов ИЛ-2 приводит к постепенному уменьшению скорости роста, которую можно восстановить только повторной стимуляцией антигеном. Таким образом, повторная стимуляция служит двум целям — восстановлению чувствительности к ИЛ-2 и отбору антиген-специфи-ческих Т-клеток. Следует отметить, что мы никогда не наблюдали образования независимых от повторной стимуляции Т-клонов, приобретающих способность неограниченно расти в присутствии ИЛ-2. О возникновении таких клонов неоднократно сообщали авторы, работающие с Т-клетками мыши. Главное усовершенствование в культивировании Т-клеток человека состоит в возможности использования рекомбинантного ИЛ-2. При этом облегчается контроль условий культивирования и при достаточно высоких концентрациях ИЛ-2 отпадает необходимость в частых повторных стимуляциях.
В отличие от других исследователей (Pawelec et al., 1983), которые обнаруживали низкую стабильность и, как правило, быструю утрату функции у аллореактивных пролиферирующих клонов, мы с помощью описанной выше методики смогли культивировать некоторые Т-клеточные клоны в течение длительного периода (до 1 года) при полной сохранности их специфичности и функциональных свойств. Только время от времени мы наблюдали утрату хелперной функции и способности к аллоген-индуцируемой пролиферации, что, как правило, было обусловлено контаминацией культур микоплазмой. Микоплазма не только понижает ростовой потенциал и угнетает хелперную функцию Т-клеток, но и уменьшает также поглощение клетками 3Н-тимидина, поскольку способна к его метаболической деградации (Sinigaglia et al., 1985). В силу этого важно как можно чаще проверять клеточные линии на присутствие мико-
278 Глава 16
плазмы, особенно в тех случаях, когда наблюдается несоответствие между морфологическим состоянием культур и данными по включению 3Н-тимидина.
Использование аллореактивных хелперных клонов позволяет разработать хелперный тест, обладающий следующими характеристиками: 1) активация В-клеток происходит в культурах, которые не содержат специфических цитотоксических предшественников, и, следовательно, в этих культурах не возникает цитотоксической (супрессорной) активности; 2) к пролиферации и синтезу антител индуцируется большая часть В-клеток; 3) В-клетки активируются независимо от специфичности вырабатываемых ими антител и в отсутствие чужеродных антигенов.
Необходимость использования клонированных Т-клеток для получения сильной поликлональной активации В-клеток определяется тем, что те же самые хелперные клоны, которые «запускают» В-клеточный ответ, выполняют хелперные функции в отношении цитотоксических предшественников (Ramarli et al., 1984). Поэтому, если в культуры, в которых В-клеточный ответ стимулируется с помощью аллореактивного хелперного клона, добавить Т-клетки периферической крови, аллогенные по отношению к используемым В-клеткам, то одновременно со стимуляцией В-клеток происходит специфическая цитотоксиче-ская реакция и, следовательно, подавление В-клеточного ответа. Вместе с тем Т-клетки периферической крови, которые аутологичны активированным В-клеткам, существенно не влияют на продукцию антител, так как среди них нет специфических цитотоксических предшественников.
Настоящий метод обеспечивает возможность использования неограниченного числа хелперных Т-клеток и позволяет избежать возникновения супрессорной активности. Поэтому с его помощью удается получить такой уровень поликлональной активации В-клеток, который приблизительно в 100 раз превосходит уровень активации, достигаемый обычными методами с использованием митогена из лаконоса или вируса Эпштейна— Барра (Yarchoan et al., 1983). Эти преимущества становятся особенно очевидными, если сравнивать эффективность клонирования и размер клонов В-клеток. Из результатов, представленных в табл. 16-1, можно сделать вывод, что отдельная активированная В-клетка может разделиться в среднем 8 раз на протяжении 8 сут и дать начало клону, вырабатывающему нанограммы антител. Следует отметить, что только описанная аллореактивная система позволяет обнаружить IgE-предшест-венники, которые встречаются с низкой частотой (Lanzavecchia„. Parodi, 1984).
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed