Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Лефковитса И. -> "Иммунологические методы исследований" -> 106

Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.

Лефковитса И., Перниса Б. Иммунологические методы исследований — М.: Мир, 1988. — 530 c.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка): immunologicheskiemetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 239 >> Следующая

Б. Культивирование клонов аллореактивных Т-клеток
Клоны аллореактивных хелперных Т-клеток, подобно всем активным Т-клеткам, требуют для размножения in vitro в качестве ростового фактора только ИЛ-2. Способность к ответу на ИЛ-2, однако, со временем падает вследствие обратной регуляции1) (down regulation) рецепторов для ИЛ-2. Экспрессия рецепторов ИЛ-2 и, следовательно, способность к ответу на этот фактор роста могут быть восстановлены с помощью повторной стимуляции Т-клеток антигеном (Meuer et al., 1984).
Короче говоря, в любой момент жизни ИЛ-2-зависимой культуры, когда проявляется тенденция к снижению скорости роста, в том числе и в тех случаях, когда размножение прекращается, клетки собирают, промывают и 2-105 Т-клеток вновь стимулируют в 2 мл среды RPMI — СПК в лунках 24-луноч-
'> Обратная регуляция (down regulation) —это уменьшение числа рецепторов гормона на поверхности клетки в ответ на увеличение концентрации гормона нли при его постоянном действии. — Прим. перев.
Выделение клонов аллореактивных Т-хелперов
275
ных панелей с помощью 10® облученных МПК, полученных от того же, что и ранее, донора (сравнимые результаты могут быть получены при использовании 10s облученных клеток ЛКЛ, полученных от того же донора). Если запас специфических клеток-стимуляторов уже исчерпан, то можно использовать 106 облученных МПК от любого донора в присутствии. 1 мкг/мл лейкоагглютинина. Через 4 дня Т-клетки вновь переносят в среду GM. При помощи чередования циклов ИЛ-2-за-висимого роста (приводящих к получению большого числа действительно «чистых» Т-клеток) и специфической повторной стимуляции аллоантигенами такие Т-клоны удается поддерживать в культуре в течение длительного времени (до 1 года); при этом сохраняются их специфичность и функциональные свойства. Если, как рекомендуется, аликвоты каждого клона хранить в замороженном состоянии, то их можно периодически размораживать и немедленно стимулировать соответствующими облученными клетками.
Г. Пролиферативный тест
С помощью этого теста измеряют способность Т-клеточных клонов пролиферировать в ответ на клетки-стимуляторы в отсутствие экзогенного ИЛ-2. Этот тест, следовательно, предназначен для определения аллоспецифичности Т-клеточных клонов.
Т-клетки собирают из ИЛ-2-зависимых культур, трижды промывают и добавляют их (2-104) к облученным МПК (Ю5) или к облученным клеткам ЛКЛ (Ю4) в 200 мкл RPMI — СПК в лунки 96-луночных плоскодонных панелей. В контроле присутствуют: 1) только Т-клетки, 2) Т-клетки плюс 10 ед./мл ИЛ-2 и 3) только клетки-стимуляторы. Через 48 ч инкубации при 37 °С в культуры вносят 1 мкКи 3Н-тимидина (Amersham, удельная активность 5 Ки/ммоль) и еще через 16 ч собирают клетки и определяют включившуюся в них радиоактивность на сцинтилляционном счетчике.
Д. Хелперный тест активации В-клеток
При культивировании аллореактивного хелперного клона с В-клетками и макрофагами, несущими соответствующий аллоантиген, индуцируется сильная поликлональная активация В-клеток. В соответствии с типом В-клеточного ответа, который должен быть проанализирован, хелперный тест может быть проведен различными способами. Обычно собирают Т-клетки из ИЛ-2-зависимых культур, трижды промывают их и культивируют с неким источником В-клеток (либо с МПК, либо с «не-Т-клетками»), В этой системе присутствие Т-клеток в препаратах В-клеток не оказывает влияния на степень
18*
276 Глава 16
В-клеточной активации, поскольку такие Т-клетки, будучи аутологичными по отношению к отвечающим В-клеткам, не являются цитотоксически ми.
Для скрининга рекомендуется культивировать различные количества клонированных Т-клеток (от 2-104 до 1,25-103) с МПК (105) или «не-Т-клетками» (3-104) в 200 мкл RPMI— СПК в лунках плоскодонных микропанелей. В качестве контроля используют культуры, содержащие только Т-клетки, и культуры, содержащие только МПК. Число В-клеток с цитоплазматическим иммуноглобулином можно измерить через 6 сут с помощью иммунофлуоресценции, а количество секретируемого иммуноглобулина в среде — через 8 сут с помощью иммунофер-ментного анализа (ELISA). В описанных выше условиях оптимальная стимуляция В-клеток происходит только при использовании 5—10 -103 Т-клеток, в результате чего образуется 100—300 мкг иммуноглобулина на 1 мл среды.
Частоту встречаемости В-клеток, активированных к выработке данного изотипа антител, можно определить с помощью метода лимитирующих разведений (МЛР) (см. обзор Lefcovits, Waldmann, 1979). Обычно культивируют различное число В-клеток (в том интервале, в котором это число лимитирует исследуемый ответ) в нескольких (24—60) параллельных опытах с постоянным числом Т-хелперных клеток и облученных клеток-стимуляторов. Тип системы с лимитирующим разведением и число культивируемых клеток зависят от частоты встречаемости исследуемых В-клеток. Культивирование можно проводить в лунках панелей Терасаки в объеме 20 мкл, содержащем Ю3 Т-клеток и 104 облученных МПК, используемых как стимуляторы; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 100 на лунку. При более низкой частоте встречаемости отвечающих В-клеток культивирование можно проводить в лунках с V-образным дном 96-луночных панелей, содержащих по 104 Т-клеток и 5-104 МПК в 200 мкл RPMI — СПК на лунку; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 104 на лунку.
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 239 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed