Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 15-2. Обнаружение секретируемых антител.
к предметному стеклу. Если фильтровальная бумага сдувается потоком теплого воздуха, происходит пересушивание геля. На обезвоженный гель немедленно наслаивают смесь, предназначенную для выявления зон гемолиза или накрывают его кусочком нитроцеллюлозы.
1. Выявление зон гемолиза
Для определения общей секреции иммуноглобулинов мы используем вариант метода локального гемолиза с А-белком, основанный на способе Ерне (Jerne, Nordin, 1963) в модификации Гроновича1) (Gronowicz et al., 1976). 100 мл СР с глюкозой (1 г/мл), содержащие 0,5 г бактоагара и 1,5 мл ДЭАЭ-декстрана (0,75 мкг/мл), трижды доводят до кипения и затем помещают в водяную баню, нагретую до 45 °С. Баню следует расположить около столика для проведения реакции гемолиза. Конъюгированные с А-белком бараньи эритроциты (БЭ) готовят в соответствии с рекомендациями Гроновича (Gronowicz et al., 1976). Обычно вносят при комнатной температуре в 30
Имеется в виду метод обратного пассивного локального гемолиза эритроцитов, нагруженных белком А. — Прим. ред.
262 Глава 15
стеклянных пробирок по 50 мкл БЭ, конъюгированных с А-бел-ком (25% в СР с глюкозой), 25 мкл «проявляющей» антисыворотки и 25 мкл комплемента морской свинки. В каждую пробирку (как правило, в четыре одновременно) добавляют
0,5 мл 0,5%-ного агара, разогретого до 45°С; смесь встряхивают для перемешивания ингредиентов и наслаивают поверх обезвоженного геля. Через несколько минут предметные стекла переносят в чашку Петри (диаметром 150 мм), накрывают крышкой и помещают в увлажненный инкубатор при 37 °С. Зоны гемолиза становятся заметными через 5—6 ч. В этом случае так же, как при любом способе выявления зон гемолиза, для оптимизации результатов важно титровать каждый ингредиент.
2. Перенос на нитроцеллюлозу
Можно также выявлять секретируемые антитела с помощью переноса иммуноглобулинов на нитроцеллюлозные фильтры. С этой целью на обезвоженный агаровый гель помещают квадратики нитроцеллюлозы (НЦ) размером 40X40 мм, предварительно смоченные в ЗФР. На НЦ-фильтры кладут квадратики фильтровальной бумаги Whatman того же размера и инкубируют предметные стекла при 37 °С во влажной атмосфере. Антитела пассивно диффундируют в НЦ и связываются с ней. Максимальное связывание достигается через 5 ч, однако минимальное связывание антител можно обнаружить уже через
15—30 мин. По завершении переноса НЦ-фильтры удаляют и помещают в ЗФР, содержащий 1% БСА. Этот этап необходим для насыщения непрореагировавших участков связывания белка на НЦ. После промывки в ЗФР фильтры погружают в ЗФР, содержащий изотип-специфические «проявляющие» антитела. Можно использовать как антитела, меченные изотопами, так и антитела, конъюгированные с ферментом. И тот и другой способ дают сопоставимые результаты. Достаточно эффективны в этих случаях меченые аффинно-очищенные гетероантисыворотки. Однако мы используем, как правило, сэндвич-метод. При этом первым реагентом служат крысиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов мыши, а вторым, «проявляющим» — конъюгированные с р-галактозидазой мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов крысы. Эта система имеет то преимущество, что для обнаружения всех типов секретируемых иммуноглобулинов требуются только одни меченые антитела. В контрольных экспериментах мы обнаружили, что способ переноса на НЦ выявляет приблизительно на 20% больше колоний, секретирующих антитела, чем соответствующий метод, основанный на определении зон гемолиза (Sauter, Paige, 1985).
Дифференцировка предшественников В-клеток
263
3. Оптимизация и контроль специфичности
Для оптимизации методики обнаружения антител и обеспечения специфичности используемые реагенты титруют и проверяют, используя в качестве стандартов наборы миеломных белков. Это делают с помощью простого теста, в котором известное количество очищенного миеломного белка связывают с НЦ-фильтром. После связывания и инактивации свободных участков связывания фильтры служат тест-панелью для меченых реагентов. В серии других контрольных опытов миелом-ные клетки выращивают в агаре в условиях, идентичных тем, которые используют для роста предшественников В-клеток. После того как колонии достигают должного размера (от нескольких дней до 2 нед), агаровый гель удаляют и обрабатывают либо по методике, основанной на выявлении зон гемолиза, либо по способу переноса продуктов секреции на НЦ.
Д. Стимуляторы и условия роста
1. Общие замечания
Хотя нам удалось найти условия, обеспечивающие рост и дифференцировку предшественников В-клеток, мы пока еще не знаем, что именно в этих условиях является существенным. Более того, до сих пор мы ограничивались поисками оптимальных условий лишь для выявления предшественников антитело-секретирующих клеток. Такой подход был необходим в начальной стадии наших исследований, для того чтобы отличать колонии, содержащие В-клетки, от более многочисленных колоний миелоидного ряда. Еще одно преимущество этого подхода состоит в том, что он позволяет следить только за теми предшественниками В-клеточного ряда, которые способны превращаться в полностью функциональные В-клетки. Вместе с тем необходимо иметь в виду, что условия, найденные при этом подходе, могут благоприятствовать только размножению, но не последующей дифференцировке предшественников В-клеток.
