Иммунологические методы исследований - Лефковитса И.
ISBN 5-03-0011-70-6
Скачать (прямая ссылка):
Voiler A., Bidwell D. E., Bartlett A. (1976). Bull. WHO, 53, 3418.
Yarchoan R., Tosato G., Blease R. М., Simon R. М., Nelson D. L. (1983). J. Exp_ Med., 157, 1.
Глава 17
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
X. фон Бёмер, В. Хаас
I. ВВЕДЕНИЕ
Для биохимического и генетического изучения структуры секретируемых лимфокинов, а также рецепторов лимфокинов и антигенов требуются клонированные популяции Т-клеток. Кроме того, Т-клеточные клоны могут быть использованы при исследовании регуляции секреции лимфокинов антигенами и экспрессии соответствующих рецепторов. В прошлом мы различали два типа клонов цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в отношении ростовых потребностей: клоны ЦТЛ-А, которые поддерживали в культуре с помощью регулярных добавок клеток-стимуляторов и факторов роста Т-клеток (ФРТК), и клоны ЦТЛ-В, которые могут расти в среде с ФРТК, но без каких-либо клеток-стимуляторов или питающих клеток. В настоящее время мы различаем большее число типов клонов ЦТЛ как в отношении их ростовых потребностей и характера антиген-зависимой экспрессии рецепторов лимфокинов, так и в отношении их способности к секреции лимфокинов. В этой главе мы опишем методики, используемые для выращивания различных типов клонов ЦТЛ, а также методики, которые мы применяли для получения цитолитических Т-клеточных гибридом.
II. МАТЕРИАЛЫ
А. Сбалансированный солевой раствор
Клетки промывали сбалансированным солевым раствором (СР).
Для приготовления СР в 1 л дистиллированной воды растворяли:
0,01 г фенолового красного 0,14 г СаС12-2Н20
8,00 г NaCl 0,40 г КС1
282 Глава 17
0,20 г MgS04-7H20 0,06 г КН2Р04
0,24 г Na2HP04-2H20
Б. Среда без Са2+ и Mg2+
Для приготовления среды, используемой для отделения от подложки прикрепившихся к ней клеток, в 5 л дистиллированной воды растворяют:
0,05 г фенолового красного
41.00 г NaCl
1.00 г КС1
14,43 г Na2HP04-12H20
1.00 г КН2Р04
1,45 г ЭДТА TitriplexRIII (Merck, Darmstad, ФРГ).
В. Солевой раствор для ГКН-буфера
Чтобы приготовить солевой раствор ГКН-буфера, используемого для растворения полиэтиленгликоля, в 1 л дистиллированной воды растворяют:
0,40 г КС1
8.00 г NaCl
1,77 г Na2HP04-2H20
0,69 г Н2Р04-Н20
Г. Раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ)
В каждом опыте по гибридизации используют свежеприготовленный раствор полиэтиленгликоля. Для приготовления 40%-ного раствора ПЭГ смешивают:
2,20 мл солевого раствора для ГКН-буфера
0,80 мл дистиллированной воды
0,04 мл 0,1 н. NaOH
2.00 г ПЭГ (мол. масса 4000; Merck, номер по каталогу 9727)
Смесь кипятят 10 мин и затем охлаждают до 37 °С.
Д. Нормальная среда для культивирования
Для приготовления нормальной среды для культивирования смешивают приблизительно 900 мл дистиллированной воды, 17,67 г сухой среды МСИДИ (1-литровые упаковки, Gibco Europe, Paisley, Англия), 3,024 г NaHCOs, 0,500 мл 0,1 М
2-МЭ (Merck-Schuchhardt, Hohenbrunn, ФРГ, номер по каталогу 805740). [Вместо меркаптоэтанола можно добавлять
Цитолитические Т-клеточные клоны и гибридомы
283
0,630 мл 1%-ного (по объему) L-тиоглицерола (Sigma, St. Louis, МО, номер по каталогу 11-1753), 105 ед. пенициллина и 100 мг стрептомицина (КС Biological, Lenexa, KS) в 10 мл дистиллированной воды.] Объем доводят дистиллированной водой до 1 л.
В завершение добавляют 100 мл СПК. Среду фильтруют и хранят при —20 °С в аликвотах по 200 мл.
Е. Среда, содержащая фактор роста Т-клеток (ФРТК)
Среду, содержащую ФРТК, готовят так, как описано у Шрейера и Тиса (Schreier, Tees, 1980). Клетки селезенки крыс Lewis инкубируют в нормальной культуральной среде (5Х ХЮ6 клеток/мл), содержащей 4 мкг/мл Кон-А. Через 48 ч над-осадочную жидкость собирают, фильтруют и хранят при •—20 °С. Обычно готовят 4—5-литровые партии, используя клетки селезенки от 50 крыс. Надосадочную жидкость проверяют на содержание стимулирующей рост активности, используя ФРТК-зависнмую клеточную линию CTL-L16, полученную от д-ра Смита (К. Smith, Dartmouth), и разбавляют в соответствии с титром ФРТК (обычно 1 : 5) нормальной культуральной средой. Полученную среду, содержащую неочищенную надосадочную жидкость, назвали CS-средой. Частично очищенный ФРТК получают из культуральной среды для клеток селезенки крыс, в которой содержатся митоген и 0,025% БСА вместо сыворотки. После 48 ч инкубации клеток в такой среде ее собирают, белки осаждают сульфатом аммония при 80% насыщения, диализуют и фракционируют на сефадексе G-100 (Schreier et al., 1980). Во фракциях определяют активность (титр) ФРТК и объединяют наиболее активные из них. Частично очищенный ФРТК добавляют в нормальную культуральную среду, обычно до конечной концентрации 5%. В этом случае пролиферация клеток CTL-L16 была оптимальной.
В последнее время мы добавляли в нормальную культуральную среду ФРТК человеческого происхождения, который был получен в результате клонирования соответствующего гена в Е. coli (W. Fiers, Ghent, Бельгия). Этот препарат был предоставлен фирмой Biogen (Женева, Швейцария).
