Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кондрахин И.П. -> "Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики" -> 81

Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.

Кондрахин И.П., Архипов А.В., Левченко В.И., Таланов Г.А., Фролова Л.А., Новиков В.Э. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики: Справочник. Под редакцией Сайтаниди В.Н. — М.: Колос, 2004. — 520 c.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка): metodvetkllabdia2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 246 >> Следующая


Расчет содержания флуоресцирующих оснований Шиффа ведут по формуле

А _ Е0~ЕЫ Ест - Еы '

171

где А — содержание оснований Шиффа, относительных единиц на 1 мл сыворотки; E0 — флуоресценция опытной пробы; Е„ — флуоресценция стандартного раствора хинин-сульфата, принятая за 1 ед.; E]1n — флуоресценция чистого хлороформа.

Примечания. 1. Сыворотку для анализа можно хранить в холодильнике не более 1 сут. 2. Хлороформ перед использованием очищают перегонкой.

Клиническое значение. Концентрация в сыворотке крови животных флуоресцирующих оснований Шиффа колеблется от 0,10 до 0,30, в том числе у кур от 0,30 до 0,60 отн. ед/мл сыворотки. Активизация процессов ПОЛ, вызываемых различными эндогенными и экзогенными факторами, указанными выше, сопровождается увеличением концентрации соединений типа оснований Шиффа.

Источник: 11.

3.3.8. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

Определение активности супероксиддисмутазы (КФ.1.15.1.1) в эритроцитах. Принцип. Метод основан на торможении су-пероксиддисмутазой (СОД) восстановления бесцветных тетразоли-евых солей супероксидными анионрадикалами, при котором происходит их превращение в окрашенные соединения (формазаны).

Реактивы: 0,2 ммоль/л раствор ЭДТА-Na. 37 г ЭДТА-Na (трилон Б) растворяют в 500 мл дистиллированной воды;

0,05 моль/л раствор тетраметилендиамина (ТЭМЭД). 0,28 мл ТЭМЭД растворяют в 40 мл 0,2 ммоль/л раствора ЭДТА-Na. Реактив годен для использования через 2 ч после приготовления в течение 1 сут;

0,034 ммоль/л раствор рибофлавина. 1,3 мг рибофлавина растворяют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 20—30 мин в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в склянке из темного стекла. Годен в течение рабочего дня;

0,85 ммоль/л раствор пара-нитротетразолия хлористого (п-НТХ). 32 мг п-НТХ растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Реактив растворяется медленно, поэтому следует это делать на магнитной мешалке с подогревом до 50 °С. Хранят в склянке из темного стекла в течение 1 мес;

0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,8. 1,3616 г KH2PO4 растворяют в 100 мл воды; 16,036 г Na2HPO4 • 2H2O растворяют в 900 мл воды. К одной части раствора калия фосфата добавляют 9 частей раствора натрия фосфата и pH определяют в помощью pH-метра;

0,1 моль/л буфер, pH 9,85. Для этого половину буферного раствора с pH 7,8 оставляют, а другую половину с помощью концентрированного раствора KOH доводят до pH 9,85;

1%-ный раствор калия йодида;

0,9%-ный раствор натрия хлорида;

172

хлороформ-этаноловая смесь (ХЭС) в соотношении 5 : 3 (об/об.).

Оборудование: ФЭК; лампа дневного света мощностью 40 Вт, длина трубки 1 м и более; штатив для пробирок на 20—30 гнезд в один ряд, закрытый спереди и сзади черной бумагой; весы аналитические; магнитная мешалка; секундомер; центрифуга рефрижераторная; холодильник бытовой; баня водяная; колбы мерные; пипетки с делениями разные; пробирки химические и центрифужные.

Ход определения. Для исследования берут эритроциты, отмытые трижды холодным 0,9%-ным раствором натрия хлорида из 0,5 мл гепаринизированной крови, добавляют 5 мл охлажденной до 1—4 °С дистиллированной воды и ставят в ледяную баню на 15 мин для полного гемолиза. Затем 1,5 мл гемолизата переносят в центрифужные пробирки, прибавляют по 0,5 мл ХЭС, перемешивают и оставляют стоять на 10—15 мин в ледяной бане^ После этого пробирки центрифугируют при 0—4 °С и 3000 мин 1 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (бесцветную или слегка желтую) разбавляют дистиллированной водой в 20 раз. Половину полученного раствора (биологического материала) оставляют в химических пробирках в ледяной бане, другую половину помещают в кипящую водяную баню на 10 мин (вода должна постоянно кипеть) для инактивации фермента.

Для каждой пробы берут по три химических пробирки, ставят в закрытый штатив и добавляют в них растворы реактивов и биологический материал (табл. 31).

31. Порядок приготовления растворов для определения активности КФ 1.15.1.1

Ns п/п
Реактив
Опыт, мл
Контроль, мл
Контроль на реактив, мл

1
0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 7,8
1,0
1,0


2
0,1 моль/л фосфатный буфер, pH 9,85


2,0

3
0,05 моль/л ТЭМЭД
1,0
1,0


4
0,85 моль/л п-нитратетразоля
1,0
1,0
1,0

5
Вода дистиллированная
5,0
5,0
5,0

6
Биологический материал (БМ)
0,2



7
БМ после кипячения

0,2
0,2

8
0,034 ммоль/л раствор рибофлавина
2.0
2,0
2,0

Содержимое пробирок старательно перемешивают и штатив с ними устанавливают на расстоянии 20 см от лампы дневного света. Включают лампу, прогревают ее в течение 10 мин. Открывают переднюю стенку штатива, облучают пробы в течение 5 мин (по секундомеру) и закрывают переднюю стенку штатива.

Во все пробирки добавляют как можно быстрее по 1 мл 1%-но-го раствора калия йодида (для остановки реакции) и сразу интенсивно перемешивают.

173

Измеряют оптическую плотность каждой пробы при зеленом светофильтре в кюветах с ходом луча 20 мм против дистиллированной воды.
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 246 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed