Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
где А — активность фермента, ME (мкмоль пероксида водорода/л ¦ мин); Ек — оптическая плотность контрольной пробы; E0n — оптическая плотность опытной пробы; 4,1 — конечный объем пробы; 16•1O5 — фактор разведения; 106 — коэффициент пересчета в мкмоль/л; 22,2•1O6 — коэффициент малярной экстинкции Н2С>2; 3 — время инкубации, мин.
Примечание. Пробы гепаринизированной крови можно хранить при 4 °С в течение 1 сут.
Клиническое значение. Каталаза — гемсодержащий фермент, встречаемый во всех тканях, где происходят процессы клеточного дыхания с участием цитохромов, т. е. где возможно образование пероксида водорода — весьма токсичного для клеток соединения, которое должно быть удалено. Каталаза содержит четыре гемовых группы на одну молекулу фермента. Наибольшая активность фермента обнаружена в печени, эритроцитах и почках. Она с высокой степенью эффективности разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород: 2H2O2 -» 2H2O + O2. Каталаза — наиболее активный из известных фермент окислительно-восстановительной системы. Одна молекула ее способна разложить 44 ООО молекул пероксида водорода в 1 с. Функция фермента — предотвращение накопления в клетках H2O2, образующегося, в частности, при дисмутации супероксидного аниона. Активность данного фермента возрастает всегда, когда активизируются процессы ПОЛ в организме и возрастает концентрация H2O2 в клетках.
В норме активность каталазы в крови животных колеблется от 20 до 60, в том числе у кур от 40 до 60 мкмоль Н202/л • мин • 103.
Источники: 11, 77.
Определение активности пероксидазы (КФ 1.11.1.7) в крови.
Принцип. Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина пероксидом водорода при участии фермента с образованием окрашенного продукта реакции, имеющего максимум поглощения при 520 нм.
Реактивы: 2,5 ммоль/л раствор бензидина. 184,2 мг бензидина растворяют при нагревании в смеси из 100 мл дистиллиро-
176
ванной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают и растворяют в нем 5,45 г трехводного натрия ацетата. После этого общий объем раствора доводят дистиллированной водой до 400 мл;
0,333 н. раствор пероксида водорода: сначала готовят 0,6%-ный раствор его и концентрацию пероксида определяют титрованием 0,1 н. раствором перманганата калия. На титрование 3 мл 0,333 н. раствора H2O2 должно пойти 10 мл 0,1 н. KMnO4. По результатам титрования раствор H2O2 доводят до нужной концентрации дистиллированной водой.
Оборудование: спектрофотометр с термостатируемой кюветой; ультратермостат; весы аналитические; секундомер; бюретки для титрования; пробирки химические.
Ход определения. К 0,1 мл основного гемолизата ге-паринизированной крови (приготовленный, как описано выше при определении активности каталазы) прибавляют 19,9 мл дистиллированной воды — рабочий гемолизат.
В термостатируемую кювету с ходом луча 10 нм приливают 2 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора пероксида водорода, предварительно подогретых до 37 °С. Содержимое кюветы перемешивают, открывают шторку камеры фотоэлемента спектрофотометра и, изменяя ширину щели, устанавливают показания спектрофотометра на нулевую отметку шкалы оптической плотности при длине волны 520 нм. В кювету добавляют 0,1 мл рабочего гемолизата, перемешивают и ровно через 1 мин (по секундомеру) снимают показатели оптической плотности опытной пробы.
Для учета изменения оптической плотности за счет неферментативного окисления бензидина аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо рабочего гемолизата 0,1 мл дистиллированной воды.
Расчет активности пероксидазы крови проводят по формуле
(E0 -Ек)- 16,08- 1Q6 Л 60 '
где А — активность фермента, ед. опт. гш/л • с; E0 — оптическая плотность опытной пробы; E^ — оптическая плотность контрольной пробы; 16,08 • 10° — фактор разведения; 60 — время проведения реакции, с.
Примечания. 1. Поскольку метод требует определения оптической плотности реакционной смеси в строго определенный момент времени, целесообразно использовать спектрофотометр с цифровой регистрацией результатов времени. 2. Пробы гепаринизирован-ной крови можно хранить при 4 °С в течение 1 сут. Клиническое значение. Пероксидаза в отличие от каталазы содержит одну гемовую группу на одну молекулу фермента. Она менее широко распространена в живой природе. В организме животных и человека пероксидаза содержится в слюне, соке
12 — 4196
177
поджелудочной железы, в тонком и толстом кишечнике, печени, почках, селезенке, легких, лейкоцитах. Как и каталаза, пероксидаза восстанавливает H2O2 до воды и молекулярного кислорода (O2), используя в качестве доноров водорода фенолы, амины, органические кислоты. Пероксидазная активность крови обусловлена в основном ее наличием в гранулоцитах. Она адсорбируется на мембранах фагоцитированных бактерий, генерирует альдегиды, синглетный кислород, другие свободные радикалы, которые повреждают клетки. Ее активность в крови колеблется от 30 до 65 ед. опт. пл./л • с. Источник: 11.
