Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 3. Характеристика ферментов, используемых в ИФА
Пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7)
Структура. Пероксидаза хрена представляет собой глобулярный белок Afr=40 ООО, диаметр молекулы 5,0 нм. Молекула состоит из апофермента (белковой части, содержащей около 18% нейтральных и аминоуглеводных остатков) и простетической группы — гемина.
Ионообменной хроматографией пероксидаза разделяется на
68
7 изоферментов, обозначаемых как А-1, А-2, А-3, В, С, D и Е, которые отличаются по аминокислотному и углеводному составу. В коммерческих препаратах пероксидазы в основном содержится изофермент С. В состав молекулы изофермента С входит 308 а. о. и 8 нейтральных углеводных остатков, связанных с остатками аспарагиновой кислоты, стабилизирующих фермент относительно воздействия протеолитических ферментов. Эти углеводные остатки имеют также существенное значение при синтезе иммуноперок-сидазных конъюгатов методом перйодатного окисления. Молекула изофермента С имеет шесть остатков лизина, содержащих свободные аминогруппы, четыре из которых находятся вблизи поверхности белковой глобулы и легко доступны для модификации.
В состав активного центра молекулы пероксидазы входит феррипротопорфирин IX (гемин), образующий с апобелком очень прочный комплекс (константа диссоциации при 20°С pH 7,0 и ионной силе 0,1 составляет 3,7-10~12 М). Степень чистоты препаратов пероксидазы характеризуется величиной RZ (Reinheits Zahl), которая соответствует отношению оптических плотностей при А,=403 и 275 нм (Л403/Л275). Хорошо очищенные препараты пероксидазы имеют RZ^3,0.
Часто для приближенной оценки концентрации пероксидазы (в мг/мл) в водном растворе pH 6—7 используют следующее соотношение:
С— А 4оз -0,44,
где А4оз — оптическая плотность раствора пероксидазы (толщина кюветы 1 см) при А,=403 нм.
Специфичность. Фермент катализирует двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода (реже органических гидроперекисей). На первой стадии взаимодействие фермента Е с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы Ej. На второй стадии происходит одноэлектронное восстановление Ei вторым субстратом АН2, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента Еп, которая после взаимодействия со второй молекулой донора переходит в нативный фермент:
е+на^е,
е,+ан2-еп+-ан
Ец4-АН2—>еН—АН
2(—АН) —> А-}-АН2
Фермент обладает широкой специфичностью по второму субстрату и способен окислять замещенные фенолы, анилины, о-фе-нилендиамины, о-дианизидин, люминол, л-аминобензойную кислоту и целый ряд других органических и неорганических соединений.
69
Измерение активности. Для измерения каталитической активности пероксидазы могут быть использованы следующие методы: фотометрический, флуориметрический, хемилюминесдентный, электрохимический.
Среди хромогенных субстратов наибольшее распространение получили о-фенилендиамин (ОФД), 5-аминосалициловая кислота и диаммониевая соль 2,2'-азино-ди[3-этил-2,3-дигидробензотиазо-лин-6-сульфоновой кислоты] (АБТС). Во флуориметрическом методе в качестве субстрата используют я-оксифенилпропионовую или гомованилиновую кислоту.
• Флуориметрический метод регистрации активности пероксидазы обладает некоторыми преимуществами по сравнению с фотометрическим: более чувствителен, низкая фоновая реакция, интенсивность флуоресценции образующегося продукта стабильна по крайней мере в течение 4 ч. Раствор субстрата может быть приготовлен заранее и храниться в течение длительного времени в замороженном состоянии при —20°С, в то время как рабочие растворы хромогенных субстратов должны быть приготовлены непосредственно перед измерением активности.
Принцип работы электрохимического датчика для определения активности пероксидазы основан на известной реакции окисления йодид-ионов перекисью водорода, катализируемой пероксидазой. Обычно регистрируют либо скорость изменения тока, либо предельный то к, проходящий через электрод за определенный промежуток времени.
Определение каталитической активности пероксидазы с использованием в качестве субстрата о-фенилендиамина (ОФД). Метод основан на фотометрической регистрации продукта окисления о-фенилендиамина, имеющего, максимум спектра поглощения при 435 нм. Так как иммуноферментный анализ обычно проводят с большим количеством образцов,, то часто для остановки ферментативной реакции используют так называемый стоп-реагент, например концентрированную H2SO4. При добавлении в реакционную смесь равного объема ОД М H2S04 максимум спектра поглощения сдвигается на 50 нм в длинноволновую область, поэтому в этом варианте регистрацию оптической плотности следует проводить при 490 нм. pH-Оптимум каталитической активности пероксидазы при использовании в качестве субстрата о-фенилендиамина равен 5. В анализе следует использовать свежеприготовленный раствор субстрата и избегать воздействия на него сильного освещения.
6 мг о-фенилендиамина растворяют в 15 мл 0,02 М фосфатцитратного буфера pH 5, добавляют 10 мкл концентрированной (30%-ной) перекиси водорода, вносят раствор фермента (или разливают в лунки микроплат, содержащие специфически сорбированные конъюгаты Ат или Аг с пероксидазой) и регистрируют изменение оптической плотности при 435 нм (или после добавления H2SO4 при 490 нм).
