Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
LO <N CN
©
us
я О
ТО
03 Л •©> ^ || •9*5
е
и*
ТО
fc(
я
о
« —V
О
Си'
о -
с-
t*2 —ч
. я —1
'
о —: 3 со
сц
я
? ^ ТО <N
ч —*
?=й 9 в
*
о
о
со
о
*
2
ч
и»
ч
о
X
ч
я
ь С4 о t'"-я^; <-•
о
LO
ю ТО со
< ч
Я <!?> я ь
о ^ я ^ о я
с< Я
<f O'
^ О)
a
3—627
65
Таблица 3.2. Ферменты, используемые в гомогенном ИФА
К Н К и
*2 л 2 а а н а> и А
* О
к я
г* о
S
5<
5.5
Си (-
4 5
О) я
fit к
Q X U
Л Н S н а .
* 2^ я ЕС
»s - *s
s »a s
Sd к «
о О) сп s * Й a,) “ 3* s
Q- a q.
H D s Q.H н 0) 2
M a s
Et О о.
S h- О
О О
Q. >» H
»К
К
4) 9*
g н
ЕЛ Ьй сг «3
0 vo
1 *
* a
Л
X
Q
<
Z
Q
С
2
I 1
сг- « Q •©*
<с <->
5 ° » * <?
I t о ОО п —. о
• • Ь2
<м^„2
•—Г СО* сз
О
<
Z
<
т я»
О)
I
1Л
00*
>> К _ «Я *
ё
о
о К в
2 ч 2
о
о
ю
О
О
О
О
о
о
К
сх
*!_;
аз
bS <N g« юе
s*
к
t* tf
о s
2 05 s
и:—.
H w—t
CQ •
•e-—
•е-S
? P3 О 00 со аз
о a
W D О u. g О
r Q. t-. e(
S
e
Q. S < X
X m
4 S сз =fC
^ CX—i' 0) •
03
«=*
Q о
CQ_U
bi
*=c
s
О
bS
О
о.
я
к
о
?=3
к
f—
QJ
a
<
G6
См. табл. 4.1.
Другие ферменты, перечисленные в табл. 3.1, находят гораздо меньшее практическое использование в гетерогенных методах ИФА. Ацетилхолинэстераза обладает высокой удельной активностью и низким значением Кт\ активность можно измерять как с помощью рН-электрода, так и фотометрически. Каталаза имеет наивысшую каталитическую активность, однако недостатком является необходимость слежения за реакцией в УФ области, что
Таблица 3.3. Минимальные определяемые количества ферментов фотометрическим и флуориметрическим методами
Нижний предел обнаружения фермента в пробе (амоль)
Фермент Субстрат флуоримет- рическая регистрация фотометри- ческая регистрация
Пероксидаза хрена о-Фенилендиа мин 4
л-Оксифенилпропионовая кислота 1 —
P-D-галактозидаза о-Нитрофенил-Р-Б-галактозид — 170
Е. coli 4-Метилумбеллиферил-|3-В-га- лактозид 0,03
Щелочная фосфата- л-Нитрофенилфосфат — 1700
за кишечника теленка 4 - Метилумбеллиферил фосфат 1,7
Глюкозооксидаза л-Оксифенилуксусная кислота 8 1
* См. табл. 4.1.
не всегда возможно. Существуют теоретические методы определения ее активности, однако они недостаточно чувствительны. В случае уреазы имеются некоторые проблемы со стабильностью конъюгатов, возможно связанные с окислением сульфгидриль-ных групп фермента, приводящим к инактивации. Наиболее распространенным среди гомогенных методов в настоящее время является так называемый EMIT-анализ, в котором в качестве метки молекул антигенов использована глюкозо-6-фосфатдегидро-геназа. Высокая активность фермента по NAD позволяет использовать его при анализе гемолизированных образцов крови, в которых возможно присутствие фермента, имеющего специфичность по NADP. Малатдегидрогеназа — очень активный фермент, однако он имеет ограниченное применение — только в анализе мочи. В гомогенном ИФА лизоцим имеет лишь историческое значение.
Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного
67
ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.
В табл. 3.2 даны предельные значения (в амолях, 10~18 моль) количества ферментов, детектируемых в растворе или на носителе при регистрации ферментативной активности в течение 1 ч фотометрическим или флуориметрическим методами.
Для сравнения отметим, что удельная активность обычно используемого в радиоиммунологическом анализе радиоизотопа 1251, имеющего период полураспада 60,2 дня, составляет 4,8 распада в 1 мин на 1 амоль.
• Таким образом, из данных таблицы следует, что флуориметри-ческий метод регистрации каталитической активности р-?>-галак-тозидазы позволяет выявлять значительно меньшие количества метки, чем радиоизотопный. Для других ферментов эти величины являются сравнимыми, а следовательно, по своей чувствительности иммуноферментные методы анализа не должны уступать радиоиммунологическим.
При разработке конкретного варианта ИФА перед исследователем встает проблема выбора фермента в качестве метки. Для правильного выбора следует учитывать многие факторы: например, в гомогенном ИФА в исследуемом образце должны отсутствовать свободный фермент-метка, или фермент, имеющий сходную с ним специфичность, ингибиторы или активаторы фермента и т. д. Выбор фермента может быть обусловлен также и целями ИФА. Например, при одновременном анализе очень большого числа образцов, выполняемого в течение довольно длительного времени, необходимо для уменьшения ошибки анализа использовать более стабильные субстраты. Гидролитические ферменты, например щелочная фосфатаза и р-?>-галактозидаза, имеют более стабильные субстраты, чем оксидоредуктазы, такие, как пероксидаза и глюкозооксидаза, поэтому последние менее предпочтительны в случае реакции с продолжительным периодом инкубации, но могут быть с успехом использованы в быстрых методах иммуноанализа.
