Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 22

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 115 >> Следующая

Int»=lnw0 — EJRT. (4.1)
В случае ферментов температурные зависимости скорости имеют более сложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых глобул, так и влиянием температуры на константы
58
Михаэлиса, константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение pH-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа Аррениуса. Србднее значение эффективной энергии активации для ферментативных процессов обычно близко к 40 кДж/моль. Как правило, зависимость скорости ферментативных реакций имеет температурный оптимум, обусловленный тепловой денатурацией фермента.
Буфер и pH. Все ферменты характеризуются определенным pH-оптимумом активности. Этот диапазон максимальной активности может иметь весьма узкий интервал. pH-Оптимум активно-1 сти зависит от ионной силы, вида используемого буфера и меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы рН-оптимум при температурах 37, 30 и 25°С составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.
Субстраты. Определяемая каталитическая активность фермента сильно зависит от используемого субстрата. Субстраты данного фермента могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент р-?>-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-р-?>-галактозид и 4-нитрофенил-р-^)-га-лактозид соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.
Эффекторы. К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, т. е. вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. Эффекторы могут вноситься в реакционную среду как с растворами реагента, так и анализируемого обра'зца.. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может прйводить к нежелательному отклонению от линейной зависимости наблюдаемой скорости ферментативной реакции от количества фермента в системе.
Экспериментальные методы определения ферментативной активности. В иммуноферментном анализе наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции.
Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400—700 нм. При прохождении пучка света через кювету раствора толщиной d (см) интенсивность прошедшего света / по сравнению с начальной интенсивностью /0 связана законом Бугера—Ламберта--Бера:
59
1—1йЛ0~‘йс, где e — постоянная для данного вещества в определенном растворе величина, называемая молярным коэффициентом поглощения (размерность [моль-1 -л-см^1]); С — концентрация вещества, поглощающего свет (моль/л). На практике часто измеряют оптическую плотность (Л), которая связана с / и /о следующим простым соотношением:
A=lg (4.2)
Таким образом, если поглощение света подчиняется закону Бугера—Ламберта—Бера, то оптическая плотность раствора в определенном диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества.
В последнее время в иммуноферментном анализе получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбужденное. Возбужденная молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдет в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбужденного состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Как отмечалось выше, оптическая плотность раствора определяется следующим соотношением:
A=?dC=\g (4.3)
Долю молекул, перешедших из возбужденного состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход ср. При условии, что ecfC<;0,I, предыдущее уравнение принимает вид
Л>~/
:2,3 eCd. (4.4)
Интенсивность флуоресценции (F) пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом (/0—/), и так как / — /0, можно записать, что
Fzz2&ltfCd. (4.5)
Таким образом, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества С и абсолютному значению начальной интенсивности света /о, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности I и /о. Этот факт позволяет на 1—2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.
60
В качестве детектирующих систем в иммуноферментном анализе нашли также применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения — реакции био-и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люцифераэами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода (реакция хемилю-минесценции) катализируется пероксидазой хрена (см. гл. 4).
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed