Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
(КФ 1.1.1.49) Структура. Фермент широко распространен и может быть выделен как из тканей млекопитающих, так и из бактерий. Молекула состоит из двух субъединиц, каждая из
74
кбторых содержит вблизи активного центра реакционноспособный остаток лизина. В иммуноферментном анализе часто используют бактериальную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу из Leuco-nostos mesenteroides. Фермент не содержит SH-групп и обладает высокой стабильностью (стабилен более года при 4°С).
Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления глюкозо-б-фосфата с образованием 6-фосфо-/)-глюконата:
глюкозо-6-фосфат + NADP+ -^б-фосфо-D -глюконат + NADP +
В отличие от фермента из млекопитающих бактериальная глю-козо-6-фосфатдегидрогеназа (из Leuconostoc mesenteroides) эффективно использует в качестве кофермента не только NADP+, но и NAD+. Большинство двухвалентных ионов металлов являются ингибиторами фермента. Mg2+ в концентрации до 10 мМ активирует, но при высоких концентрациях также ингибирует его. Ингибирующий эффект оказывают фосфат-ионы.
Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации образующейся в реакции восстановленной формы кофермента (коэффициент молярного поглощения NADPH при длине волны 340 нм равен 6,22-103 М^-см"1).
Фотометрический метод регистрации каталитической активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
В кювету спектрофотометра к 2,5 мл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 7,8 (или 0,1 М триэтаноламинового буфера), содержащего 0,03 М MgCl2, добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора NAD+ и 0,2 мл 0,15 М раствора натриевой соли глюкозоб-фосфата. Кювету термостатируют и затем вносят 50 мкл фермента (в концентрации порядка 40 мкг/мл) или его конъюгата. Фиксируют скорость изменения оптической плотности раствора при длине волны 340 нм.
Малатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.37)
Структура. В гомогенном иммуноферментном анализе обычно используют малатдегидрогеназу из сердца свиньи. Молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по 35 000. Каждая из субъединиц имеет центр связывания молекулы кофермента NAD+ и обладает каталитической активностью при диссоциации молекулы на субъединицы. Изоэлектрическая точка 6,2. Молекула содержит 14 SH-групп, две из которых существенны для связывания субстрата в активном центре. Фермент достаточно стабилен и сохраняет активность в течение года при 4°С в виде суспензии под сульфатом аммония.
Специфичность. Малатдегидрогеназа катализирует реакцию восстановления оксалоацетата до малата под действием NADH:
оксалоацетат + NADH + Н+ L-малат + NAD+
75
Каталитическую активность измеряют по скорости уменьшенйя оптической плотности восстановленной формы NADH при длйне волны 340 нм. Активаторами фермента являются фосфат, Zn2+, малат; ингибиторами — оксалоацетат, 8-оксихинолин, АМР, ADP, АТР, сульфит, тироксин, фенолы.
Фотометрический способ определения ферментативной активности малатдегидрогеназы.
В кювету спектрофотометра к 2,58 мл 0,1 М К-фосфатного буфера, pH 7,4, добавляют 0,2 мл 4,5 мМ раствора оксалоацетата в том же буфере и 0,2 мл 3 мМ раствора NADH. Кювету термостатируют и затем вносят 20 мкл раствора фермента (с концентрацией 1 мкг/мл) и регистрируют изменение оптической плотности раствора в течение 5 мин при длине волиы 340 нм.
Методы
иммуноферментного
анализа
К настоящему времени разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Опубликованы обзоры, в которых подробно рассмотрены методы ИФА. Однако единая четкая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения всех методов на гетерогенные и гомогенные, т. е. по принципу проведения всех стадий анализа — с участием твердой фазы или же только в растворе. В данной главе с учетом сложившейся в литературе терминологии дана общая классификация всех методов ИФА.
§ 1. Классификация методов ИФА
Первичным процессом в иммуноферментном и в любом другом иммунохимическом анализе является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования им-мунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов.
77
В случае анализа антигенов для проведения такой оценки сущ[е* ствует два подхода: 1) прямое измерение концентрации образов^ шихся иммунохимических комплексов; 2) определение концентрации оставшихся свободными, т. е. не вступивших в реакцию комп-лексообразования с антигеном антител. Очевидно, что в этом случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа оставшихся свободными антител (схема 4.1). При анализе антител эти подходы остаются аналогичными, но в схеме 4.1 симметрично меняются местами Ат и Аг, при этом также определяются либо сами комплексы, либо оставшиеся свободными, не связанные в комплекс антигены:
