Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
§ 1. Основные физико-химические и каталистические свойства ферментов
Структура ферментов. В активном центре фермента, образованном сближенными и определенным образом ориентированными в пространстве участками полипептидной цепи, происходит связывание субстрата и его химическое превращение. Иногда в состав таких центров входят так называемые кофакторы — низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы.
Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой (апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта, называют простетической группой.
Примером такой простетической группы может служить молекула гема (протогема-тина IX), принимающая участие, например, в катализе пероксидазой:
55
В некоторых случаях кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Такие специализированные для данного класса ферментов субстраты получили название кофер-ментов. К наиболее распространенным из них относятся АТР (аденозинтрифосфат):
и NAD+ (никотинамидадениндинуклеотид):
Отметим, что эти два кофермента нашли также самостоятельное использование в качестве меток в иммуноанализе (иммуноко-факторный анализ).
В результате целого набора взаимодействий между отдельными частями полипептидной цепи, в которых определенную роль играет и растворитель, фермент принимает специфическую активную конформацию и способен эффективно осуществлять превращение субстрата. Однако, если условия окружающей среды изменяются таким образом, что часть из этих взаимодействий нарушается или отсутствует, нативная конформация молекулы существенно меняется, при этом способность фермента осуществлять каталитическое превращение субстрата падает. Такой процесс называют денатурацией. Факторами, вызывающими денатурацию, могут являться повышение температуры, изменение pH, введение химических агентов (мочевины, солей гуанидина и др.), механическое воздейетвие. В более широком плане можно говорить об инактивации ферментов, т. е. потери ими каталитической способности, которая может быть обусловлена как денатурацией, так и химической модификацией отдельных функциональных групп молекул фермента.
В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются e-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, SH-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модификация не должна затрагивать функциональных групп активного
57
центра, а также влиять на каталитически активную конформацию всей ферментной глобулы.
Каталитические свойства ферментов. Общую схему ферментативной реакции обычно записывают следующим образом:
Sj —|— S2---Pi + P2,
где Si и S2 — субстраты; Pi и Рг — продукты ферментативной реакции; Е — фермент.
Для многих ферментов в качестве одного из субстратов выступает вода, поэтому, ввиду того, что ее концентрация велика и постоянна в ходе ферментативной реакции, часто такие реакции рассматривают как псевдомоносубстратные. Для целых классов ферментов, вторыми специализированными субстратами являются молекулы коферментов.
Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой препаратов является каталитическая активность фермента.. За единицу каталитической активности (1 каталь) любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в 1 с в реакционной системе при определенных условиях. Наиболее удобным для практических целей является нанокаталь (10~9 кат). Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как «международная единица» (U), определенное как количество фермента, катализирующее превращение 1 ммоль субстрата в 1 мин. Соотношение между этими единицами следующее:
1 нкат=10-9 кат=0,06?/.
Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют удельную каталитическую: активность, т. е. каталитическую активность, отнесенную к единице массы белка.
Согласно приведенному выше определению каталитическая активность не тождественна понятию скорости ферментативной реакции, которая определяется как количество субстрата, превращаемого ферментом за единицу времени в единице объема системы, в которой протекает реакция (размерность [моль-л-1 X Хс-1]). На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются температура, природа буфера и pH, субстраты, коферменты, ингибиторы и другие эффекторы, а также количество белка в системе.
Температура. Влияние температуры (Т) на скорость (v) обычных химических реакций описывается зависимостью Аррениуса:
