Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
100 мг D-глюкозы растворяют в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 5,5, раствор выдерживают в течение часа, чтобы полностью прошла мутаротация глюкозы. К полученному раствору добавляют 1 мг пероксидазы хреиа и 2,5 мл (1 мг/мл) о-фенилендиамина. В кювету, содержащую специфически сорбированные иа стенках конъюгаты глюкозооксидазы с Ат или Аг, приливают 1 мл приготовленного раствора. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,1 мл концентрированной H2S04. Регистрируют изменение оптической плотности при длине волны 490 нм.
Флуориметрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием п-оксифенилукусной кислоты.
В 50 мл 0,05 М ацетатного буфера pH 5,0 растворяют 50 мг я-оксифенил-уксусной кислоты, доводят pH до 5,0 с помощью 10 М NaOH и добавляют 1 мг пероксидазы. К 0,25 мл полученного раствора добавляют 10 мкл раствора глюкозооксидазы в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,0, содержащем 0,1 М NaCl и 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, и смесь инкубируют при 30°С в течение 5 мин. Ферментативную реакцию инициируют и проводят обычно в течение 10—60 мин при 30°С. Для остановки реакции добавляют 2,5 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения 320 нм, испускания— 405 нм).
Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1)
Структура. Продажными препаратами щелочной фосфатазы являются фермент из кишечника телят и из Е. coli. В качестве метки в иммуноферментном анализе обычно используют первый из них, так как он обладает более высокой удельной каталитической активностью. Молекула щелочной фосфатазы представляет собой димер с Мг~ 100 000. В состав каждой из субъединиц входят два сильно связанных атома цинка, один из которых существен для поддержания структурной целостности молекулы, а второй входит в состав активного центра и принимает участие в каталитическом акте.
Специфичность. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров, в том числе первичных и вторичных .спиртов, сахарных спиртов, циклических спиртов и фенолов:
моноэфир ортофосфорной кислоты + НгО * СПИрТ+РС^3-Ионы Mg2+ являются сильными активаторами фермента. Фосфат-ион и хелаты двухвалентных металлов, например ЭДТА, ингибируют фермент. На активность щелочной фосфатазы значительное влияние оказывает электростатическое окружение (ионная сила, растворитель).
В сухом виде или в суспензии (3,2 М раствора сульфата аммония), pH 7, содержащего 1 мМ MgCU, щелочная фосфатаза стабильна в течение нескольких месяцев при 4°С.
73
Фотометрический метод определения каталитической активности щелочной фосфатазы с использованием 4-нитрофенилфосфата.
Растворяют 1,1 г 4-нитрофенилфосфата (динатриевая соль X 6Н20) в 4 мл воды и доводят объем до 5 мл. В кювету спектрофотометра вносят 3 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,5, содержащего 1 мМ MgCl2 и 0,1 мМ ZnCl2. Кювету термостатируют при 30°С в течение 5 мин и добавляют 20 мкл раствора фермента. Реакцию инициируют добавлениемЗО мкл раствора 4-нитрофенилфосфата. Следят за увеличением оптической плотности при длине волны 405 нм (коэффициент молярного поглощения л-нитрофенолят-иона 18 500 М-1 см-1).
Флуориметрический метод определения ферментативной активности с использованием 4-метилумбеллиферилфосфата.
Готовят 0,3 мМ раствор субстрата, растворяя 2,6 мг 4-метилумбеллиферилфосфата в 33,3 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. В кювету, содержащую специфически сорбированный на стенках конъюгат фермента с Аг или Ат, добавляют 0,1 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3, содержащего 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ZnCl2, 0,5 г/л NaN3 и 250 иг/л альбумина. Раствор инкубируют при 30 °С в течение 5 мин и инициируют реакцию добавлением 50 мкл раствора субстрата. Через 10—60 мин реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 0,5 М К2НРО4-КОН буфера, pH 10,4, содержащего 10 мМ ЭДТА. Измеряют интенсивность флуоресценции раствора (длина волны возбуждения 360 нм, испускания 450 нм).
p-D-Галактозидаза (КФ 3.2.1.23)
Структура и специфичность. p-D-галакто-зидаза из Е. coli имеет молекулярную массу около 540 000, молекула содержит значительное число SH-групп (количество титруемых SH-групп зависит от качества препарата и может составлять 20—24). Коэффициент молярного поглощения при длине волны 280 нм равен 1,13* 106 М_1*см-1. Фермент катализирует гидролиз p-D-галактозидов, обладает достаточной стабильностью; в кристаллической суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония (pH 6) сохраняет активность при 4°С в течение нескольких месяцев. Ионы Na+ являются ингибиторами фермента. Фотометрический метод определения каталитической активности с 4-метилумбеллиферил-$-Ь-галактозидом.
10 мг 4-метилумбеллиферил-|3-0-галактозида растворяют в 2 мл диметил-формамида при встряхивании в течение 4—5 ч и добавляют 98 мл деионизованной воды. В реакционную ячейку, содержащую фермент, добавляют 0,1 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,1 М NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,05—1 г/л бычьего сывороточного альбумина и 1 г/л азида натрия. Раствор инкубируют при 30 °С в течение 5 мин и инициируют реакцию добавлением 50 мкл раствора субстрата. Через 10—60 мин реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции (длина волны возбуждения 360 нм, испускания — 450 нм).
