Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
T-i^MlArl-HATD + fc-x. (3.39)
Величина т называется временем релаксации. Анализ зависимости в координатах I / х — -ь- ([Аг] +1Ат]) позволяет найти по тангенсу угла наклона прямой значение ki, а по отрезку, отсекаемому на оси ординат, k~\ (рис. 15).
Определение констант скоростей комплексообразования с использованием меченых реагентов. Этот метод, нашел большое применение в связи с развитием высокочувствительных методов иммуноанализа, основанных на использовании меченых реагентов: радиоим-мунологического, иммунофер-ментного и других методов. Кинетические закономерности простейшей схемы (3.38) взаимодействия антиген — антитело (моноклональные ‘антитела —одновалентный антиген) описывает система дифференциальных уравнений:
??ГА^Ат] =*! [Аг] [Ат] -k-, [Аг-Ат];
-1^11=_А1[Аг] [Ат] + *_! [Аг-Ат]; (3.40)
= -k^ IАг11Ат1 + *-i IАг • Ат1-
С учетом уравнения материального баланса
IАт]о=[Ат]+[Аг• Ат]; [Аг]0=[Аг] +[Аг-Ат] _ <3.41)
и начальных условий (^=0, [Аг-Ат]=0) можно получить решение системы
Рис. 15. Определение кинетических констант взаимодействия моновалентного антигена с субпопуляцией антител по методу температурного скачка
52
[Аг-Ат1=—, (3.42)
а _ --2М,/
а — Ь
где и — -1-((Аг1,+1Ат1,1
»= j/ ( Ml±J»IlL+b1Z«!_j!_1Arl„ [Ат],. (3.43)
Весьма существенным параметром в «ммуноферментном анализе является время установления равновесия в системе. Если считать, что t равн определяется условием [Аг. Ат] - [Аг-Ат]рав„
= е, (3.44)
I [Аг.Ат]равн
то время установления равновесия можно найти по формуле
'»"=1ЙГ‘"[(1+1^)Ш]- <3-45>
Так как для вычисления времени необходимо точное значение констант скоростей k\ и k~i, которые часто неизвестны, то это уравнение обычно используют лишь для самой грубой оценки времени установления равновесия.
?Определение константы скорости ассоциации. 1. Наиболее простой метод основан на регистрации начальной скорости Vo образования комплекса Аг-Ат, тогда
^i== Vo/([At]0-[Аг]0. (3.46)
Однако метод недостаточно точен, так как определение [Ат]0 и Vo обычно производится с большой ошибкой. Для повышения точности при расчетах используют несколько начальных концентраций реагентов.
2. Для нахождения k\ и -k~\ эксперимент проводят в условиях избыточной концентрации одного из реагентов. В случае применения меченого антигена используют большой избыток соответствующих антител. Выражение (3.42) для концентрации комплекса в этом случае принимает следующий вид:
[Аг-Ат1 = AI^№lb_(i_|_e-(ftltA,Jo+*-i)'). (3.47)
*1 [Ат]0 + k-i
Как видно из этого выражения, зависимость равновесной концентрации комплекса от времени описывается моноэкспоненциальной кривой с предэкспоненциальным множителем
^MATlo-f*-!, (3.48)
соответствующим эффективной константе скорости ассоциации.
53
Спрямляя зависимость (3.47) одним из известных способов, например, в координатах [Аг.Ат1
In--—?—---f1, (3.49)
[Аг-Ат],. — [Аг-Ат]
по тангенсу угла прямой вычисляют k' при заданной концентрации [Ат]„.
к'
tgoc-А,
Откладывая графически k' от концентрации [Ат]0 (рис. 16),получаем прямую, тангенс угла наклона которой дает k\, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, k-\. Данный способ расчета пригоден, когда k-i сравнима с &i[Ar]0. В противном случае
Л'=*! 1Ат]0, (3.50)
[Ч
Рнс. 16. Определение кинетических характеристик взаимодействия моновалентного антигена с субпопуляцней антител в условиях избытка начальной концентрации антител [Ат]0
что позволяет определить по тангенсу угла наклона только бимолекулярную константу скорости
ku
Определение константы скорости диссоциации. Обычно константу скорости диссоциации находят путем прямого измерения скорости процесса диссоциации комплекса в условиях его необратимости. Для этого используют один из следующих подходов.
1. После установления равновесия в системе проводят разбавление системы большим избытком буфера. Так как скорость образования комплекса пропорциональна произведению концентраций каждого из реагентов, а скорость диссоциации комплекса — его концентрации в первой степени, то при сильном разбавлении
®днс ®ас-
В этом случае процесс диссоциации комплекса Аг-Ат будет описываться экспоненциальной кривой. Спрямлением ее в логарифмических координатах можно получить константу скорости k~\.
2. В систему вносят вещества, способные быстро и полностью связывать или удалять свободный лиганд. Если скорость удаления свободного лиганда будет существенно больше скорости диссоциации комплекса, то наблюдаемая скорость распада комплекса описывается реакцией первого порядка с &-ь
3. После установления равновесия в системе антитела — меченый антиген в нее вводят избыток свободного немеченного антигена. В этих условиях процесс изменения концентрации комплекса {Аг*-Ат] также описывается кинетикой первого порядка, константа скорости которого соответствует k-i.
Ферменты как метки в иммуноанализе
Ферменты представляют собой белки, катализирующие реакции, протекающие в живых организмах. В гл. 1 рассмотрены основные структурные характеристики белков, ниже остановимся на кратком обзоре структурных особенностей молекул ферментов.
